蜂毒素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響及其部分機制研究

沈文文，趙 斌，黃 成，孟曉明，陳昭琳，吳小琴，李 俊

（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究院，安徽合肥 230032）

蜂毒素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響及其部分機制研究

沈文文，趙 斌，黃 成，孟曉明，陳昭琳，吳小琴，李 俊

（安徽醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，安徽醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，安徽省創(chuàng)新藥物產(chǎn)業(yè)共性技術(shù)研究院，安徽合肥 230032）

中國圖書分類號：R329．24；R329．25；R735.702.2；R996.3

摘要：目的 研究蜂毒素對人肝癌HepG2細胞增殖和凋亡的影響，并探討其作用和HDAC2及Hedgehog信號通路的關(guān)系。方法 給予不同濃度蜂毒素，四甲基偶氮唑鹽（MTT）法檢測HepG2細胞的增殖變化，Hoechst33258染色和流式細胞術(shù)檢測HepG2細胞凋亡變化；qRT-PCR檢測SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2 mRNA的表達；Western blot檢測SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2蛋白的表達。結(jié)果 不同濃度的蜂毒素在作用48 h后，能明顯抑制HepG2細胞的增殖，促進其凋亡；Hedgehog信號通路中SHH、PTCH1、SMO、Gli1 mR-NA及蛋白水平均明顯降低，并與蜂毒素濃度呈負相關(guān)。同時檢測到細胞內(nèi)HDAC2 mRNA及蛋白水平均降低，與蜂毒素劑量呈負相關(guān)。結(jié)論 蜂毒素可明顯抑制人肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡，其作用與抑制HDAC2，下調(diào)Hedge-hog信號通路密切相關(guān)。

關(guān)鍵詞：蜂毒素；HDAC2；Hedgehog信號通路；細胞增殖；細胞凋亡；HepG2細胞

網(wǎng)絡(luò)出版時間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．009．html

原發(fā)性肝癌（HCC）是臨床上最常見的惡性腫瘤之一，其發(fā)生發(fā)展過程復(fù)雜，多種因素共同參與，具體機制目前仍不清楚［1］。世界衛(wèi)生組織發(fā)表的《全球癌癥報告2014》顯示，我國肝癌的新增病例和死亡人數(shù)均居世界首位。大量的研究表明，Hedge-hog（Hh）信號通路的異常與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，且其作用可能受組蛋白去乙酰化酶（HDACs）的調(diào)節(jié)。在人原發(fā)性肝癌中，Hh信號通路異常表達，并通過調(diào)節(jié)自噬參與到HCC的發(fā)生發(fā)展中；在胰腺導(dǎo)管腺癌小鼠模型中發(fā)現(xiàn)，SHH信號使骨髓細胞中血管生成素Ang-1和胰島素樣生長因子IGF-1表達增加，促進腫瘤組織血管生成；在神經(jīng)前體細胞和成神經(jīng)管細胞瘤中，高表達的HDAC1和低表達REN能夠影響Hedgehog信號通路；在胰腺癌和胃癌的發(fā)生發(fā)展中，SHH／Gli信號通路能影響包括TGF-β、Ras、Wnt、Smads、生長因子、整合素等多種信號通路，增強腫瘤細胞的侵襲遷移能力。Hedgehog信號通路參與了腫瘤細胞的增殖、凋亡，并促進血管形成，影響腫瘤細胞的侵襲及遷移過程。因此針對Hh信號通路的靶向抑制為我們抗腫瘤治療提供了新的研究方向。

蜂毒是工蜂毒腺和副腺分泌的具有芳香氣味的一種透明液體。我國有著悠久的利用蜂毒治療疾病的歷史。近年來隨著分離、純化技術(shù)水平的不斷提高，作為蜂毒主要組分及重要的活性成分，蜂毒素被不斷開發(fā)并廣泛應(yīng)用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎、三叉神經(jīng)痛、偏頭痛等疾病的治療［2－3］。其能夠通過多種途徑影響細胞的信號傳導(dǎo)，誘導(dǎo)神經(jīng)酰胺合成及細胞凋亡，由此引發(fā)抗菌、抗病毒、抗腫瘤等生物效應(yīng)，引起廣泛關(guān)注。蜂毒素具有的抗腫瘤作用，呈多靶點性，可能與其直接殺傷細胞，誘導(dǎo)細胞凋亡，調(diào)節(jié)免疫及非特異性免疫功能有關(guān)，但其具體機制未明。本實驗觀察蜂毒素對肝癌HepG2細胞增殖的抑制作用和其促進凋亡作用，并探討該作用與HDAC2及Hedgehog信號通路的關(guān)系。

1　材料

1．1細胞株 HepG2細胞由安徽醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)藥理學(xué)研究所提供。

1．2試劑和儀器 RPMI 1640培養(yǎng)基由Hyclone公司提供，胎牛血清購于杭州四季青公司，MTT和DMSO，PTCH1、SMO、Gli1抗體均由Sigma公司提供，Hoechst 33258染色試劑盒及Annexin V-FITC凋亡檢測試劑盒購自上海貝博生物，逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購自MBI Fermentas公司，QuantiFast SYBR-Green RT-PCR試劑盒由QIAGEN公司提供，TRIzol Reagent及

引物合成由上海Invitrogen公司提供，β-actin抗體購自美國Cell Signaling Technology，SHH抗體由北京博奧森生物有限公司提供，羊抗小鼠和羊抗兔IgG購于北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。二氧化碳培養(yǎng)箱（Thermoforma），熒光倒置顯微鏡（日本O-LYMPUS公司），酶標(biāo)儀（biotekEL），流式細胞儀（FACSVERSE），qRT-PCR儀（Thermo Fisher Scientif-ic），Western blot儀器（Bio-Rad）。

2　方法

2．1HepG2細胞的培養(yǎng) 采用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液（105U·L－1青霉素和100 g· L－1鏈霉素），在37℃、5%CO2飽和濕度條件下培養(yǎng)，細胞為貼壁生長，胰酶消化液消化后傳代培養(yǎng)，實驗取用對數(shù)生長期細胞。

2．2細胞增殖實驗 以MTT比色法檢測HepG2細胞的增殖。實驗分為4組：空白對照組，低、中、高3個濃度組。將培養(yǎng)的HepG2細胞胰酶消化制備成細胞混懸液，每孔以細胞數(shù)4 000接種于96孔板中。細胞貼壁后，分別給予0、1、2、4 mg·L－1蜂毒素，作用48 h后，每孔加入MTT（5 g·L－1）20 μL，繼續(xù)孵育培養(yǎng)4 h后，棄上清，每孔加入DMSO 150 μL，振蕩10 min，使結(jié)晶充分溶解后，酶標(biāo)儀492 nm波長處檢測各孔吸光度，按公式計算蜂毒素對細胞的生長抑制率，生長抑制率／%＝（1－OD給藥組／OD對照組）×100%。

2．3細胞凋亡實驗

2．3．1Hoechst 33258染色法觀察細胞核的形態(tài)變化 實驗分為4組：空白對照組，蜂青素低、中、高3個濃度組。將培養(yǎng)的HepG2細胞胰酶消化后，制備成細胞混懸液，每孔以細胞數(shù)4 000接種于6孔板中。細胞貼壁后，分別給予0、1、2、4 mg·L－1蜂毒素，作用48 h后，將1／10細胞培養(yǎng)基體積的染料加入細胞培養(yǎng)物中，37℃繼續(xù)培養(yǎng)細胞15 min，PBS洗2遍，熒光倒置顯微鏡下，隨機選取4個視野，觀察細胞核的形態(tài)變化并計數(shù)，計算凋亡率，凋亡率／%＝（凋亡細胞／細胞總數(shù)）×100%。

2．3．2AnnexinV-FITC細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡 實驗分為4組：空白對照組，蜂毒素低、中、高3個濃度組。細胞制備成懸浮液后，以細胞數(shù)4 ×105接種至細胞培養(yǎng)瓶中，待細胞貼壁后，換液，實驗組分別給予1、2、4 mg·L－1蜂毒素，48 h后，用不含EDTA的胰酶消化，離心收集懸浮細胞。離心機300×g，2℃～8℃，5 min，棄培養(yǎng)基，PBS洗滌2次，重新離心收集細胞。用400 μL 1×Annexin V結(jié)合液懸浮細胞，濃度大約為1×109cells·L－1。在細胞懸液中加入5 μL Annexin V-FITC染色液，輕輕混勻后于2℃～8℃避光孵育15 min；加入10 μL PI染色液后輕輕混勻于2℃～8℃避光孵育5 min；處理結(jié)束后，使用Beckmann流式細胞儀，488 nm激發(fā)波長，按照常規(guī)流式凋亡檢測。

2．4qRT-PCR檢測SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2mRNA的表達 實驗分為4組：空白對照組，蜂毒素低、中、高3個濃度組。給藥刺激48 h后，按TRIzol試劑盒操作說明，提取細胞總RNA。提取的總RNA按Fermentas逆轉(zhuǎn)錄試劑盒操作說明，將9 μL總RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。本實驗qRT-PCR引物序列見Tab 1。采用QuantiFast SYBR-Green RT-PCR試劑盒，按2 μL cDNA、3 μL引物、5 μL SYB體系檢測SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2mRNA的表達，以β-actin做內(nèi)參，使用Piko-Real 96 Real-Time PCR系統(tǒng)軟件對實驗結(jié)果進行分析。重復(fù)3次獨立實驗。

Tab 1 Primer sequence used for Real-time Quantitative PCR

2．5Western blot檢測SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2蛋白的表達 實驗分組同上，給藥刺激48 h后，用預(yù)冷的PBS洗3次，每組加入400 μL RIPA蛋白裂解液（含PMSF 10 mL·L－1），冰上裂解30 min。4℃離心30 min，留取上清液。加入1／4體積上清液的蛋白上樣緩沖液，100℃水浴10 min，－20℃保存。配制SDS-聚丙烯酰胺凝膠，每組上樣15 μL總蛋白，80V電泳30 min后，120V電泳90 min。按蛋白marker位置切膠，200mA，BioRAD濕轉(zhuǎn)儀器將蛋白轉(zhuǎn)到激活后的PVDF膜上，根據(jù)蛋白分子量大小不同，SHH、PTCH1、SMO、Gli1、HDAC2蛋白轉(zhuǎn)膜時間依次為55、220、110、150、75 min；室溫5%脫脂奶粉，1×TBS，0.1%吐溫-20封閉3 h，1× TBS，0.1%吐溫洗膜后孵育一抗，一抗?jié)舛葹镾HH （1∶200）、PTCH1（1∶250）、SMO（1∶500）、Gli1（1 ∶500）、HDAC2（1∶1 000），4℃過夜。1×TBS，0.1%吐溫洗膜4次，每次10 min，放入與一抗匹配的二抗（1∶7 500）中孵育，室溫1 h，1×TBS，0.1%吐溫洗膜4次，每次10 min，ECL發(fā)光試劑盒顯影，

以β-actin做內(nèi)參，分析條帶吸光度值。

2．6統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件對實驗所得數(shù)據(jù)進行分析。結(jié)果以±s表示，兩組間比較采用t檢驗，3組及以上比較采用方差分析。

3　結(jié)果

3．1蜂毒素對HepG2細胞增殖的影響 在給予不同濃度的蜂毒素分別作用24、48、72 h后，MTT比色法檢測結(jié)果顯示：給予HepG2細胞1，2，4 mg·L－1蜂毒素作用24 h后，各劑量組細胞生長的抑制率分別為28.7%，29.4%，38.4%；作用48 h后各劑量組抑制率為29.3%，37.5%，49.8%；作用72 h后各劑量組抑制率為17.8%，27.0%，36.1%（Fig 1）。實驗結(jié)果表明，蜂毒素對HepG2細胞的增長有明顯的抑制作用，且隨給藥劑量遞增，抑制作用越明顯。因為各劑量組抑制率在作用48 h后最高，所以后續(xù)實驗均采用給藥后48 h進行檢測。以上實驗結(jié)果至少重復(fù)3次。

Fig 1 Inhibitory effect of Melittin on HepG2 cells protiferation

3．2蜂毒素對HepG2細胞凋亡的影響 在給予不同濃度的蜂毒素作用48 h后，Hoechst 33258染色結(jié)果顯示：見Fig 2（A），蜂毒素中、高劑量組（2、4 mg ·L－1）Hoechst 33258染色陽性細胞數(shù)均較空白對照組增多，其差異均有顯著性（P＜0.01）；同時流式細胞儀檢測不同濃度給藥組HepG2細胞凋亡的結(jié)果顯示：見Fig 2（B），給藥組細胞凋亡明顯增多，且與蜂毒素給藥濃度呈正相關(guān)，同空白對照組相比較，蜂毒素中、高劑量組（2、4 mg·L－1）差異有顯著性（P＜0.01），同Hoechst 33258染色結(jié)果相一致。實驗結(jié)果表明，蜂毒素能夠明顯促進HepG2細胞的凋亡。以上實驗結(jié)果至少重復(fù)3次。

3．3qRT-PCR檢測SHH、PTCH1、SMO及GLi1 mRNA的表達 在給予不同濃度的蜂毒素作用48 h后，采用qRT-PCR的方法檢測Hedgehog信號通路SHH、PTCH1、SMO及GLi1 mRNA的表達，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，PTCH1 mRNA表達降低，并且蜂毒素高濃度組（4 mg·L－1）差異有顯著性（P＜0.01），同時，SHH、SMO、Gli1 mRNA的表達均降低，且蜂毒素中、高濃度組（2、4 mg·L－1）差異均具有顯著性（P＜0.01）。實驗結(jié)果表明，蜂毒素能明顯抑制SHH、PTCH1、SMO、Gli1 mRNA的表達，見Fig 3。所有實驗結(jié)果至少重復(fù)3～4次。

Fig 2 （A）Hoechst 33258 staining results of HepG2 cells（200×）

3．4Western blot檢測SHH、PTCH1、SMO及GLi1蛋白的表達 在給予不同濃度的蜂毒素作用48 h后，Western blot檢測Hedgehog信號通路相關(guān)蛋白表達，結(jié)果顯示：與空白對照組相比，PTCH1蛋白表達降低，并且蜂毒素高濃度組（4 mg·L－1）差異有顯著性（P＜0.05），同時，SHH、SMO、Gli1蛋白表達均降低，且蜂毒素中、高濃度組（2、4 mg·L－1）差異均具有顯著性（P＜0.01），這一結(jié)果同qRT-PCR結(jié)果相符。實驗結(jié)果表明，蜂毒素能明顯抑制

SHH、PTCH1、SMO、Gli1蛋白的表達。見Fig 4。所有實驗結(jié)果至少重復(fù)3～4次。

Fig 2（B） Effect of apoptosis on HepG2 cells

Fig 3 mRNA expression of SHH，PTCH1，SMO and GLi1 in HepG2 cells

Fig 4 Protein expression levels of SHH，PTCH1，SMO and GLi1 in HepG2 cells

3．5qRT-PCR及Western blot檢測HDAC2 mR-NA和蛋白的表達 在給予不同濃度的蜂毒素作用48 h后，qRT-PCR及Western blot檢測HDAC2 mR-NA和蛋白的表達，結(jié)果顯示：與空白對照組比較，HDAC2 mRNA表達降低，且同給藥濃度呈負相關(guān)，差異具有顯著性（P＜0.01）；Western blot也得到了相類似的結(jié)果（P＜0.05）。實驗結(jié)果表明，蜂毒素能明顯抑制HDAC2的表達。見Fig 5、6。以上實驗結(jié)果至少重復(fù)3～4次。

Fig 5 mRNA expression levels of HDAC2 in HepG2 cells

Fig 6 Protein expression levels of HDAC2 in HepG2 cells

4　討論

Hedgehog信號通路主要由Hh配體、Patched （Ptc）受體、Smoothened（SMO）跨膜蛋白、核轉(zhuǎn)錄因子Gli（glioma-association oncogene homoglog）構(gòu)成。其中Hh配體有3種，SHH、IHH和DHH，目前研究發(fā)現(xiàn)在原發(fā)性肝癌中發(fā)揮主要作用的是SHH［4］。Ptc受體有兩種，分別為Ptch1和Ptch2，二者均能同Hh配體結(jié)合，負調(diào)控Hedgehog信號通路。當(dāng)Hh配體未被激活時，Pth同SMO結(jié)合，抑制SMO活性，但是當(dāng)Hh同Ptc結(jié)合后，解除了后者對SMO的抑制作用，SMO信號傳達到胞內(nèi)，激活GLi。Chung等［5］研究發(fā)現(xiàn)過表達與PTCH1同源的PTCH53能夠通過抑制SMO抑制Hh信號通路。Jeng等［6］在HCC小鼠模型上證實抑制SHH能夠抑制腫瘤的生長，降低Gli1 mRNA的表達。GLi是一個具有鋅指結(jié)構(gòu)的轉(zhuǎn)錄因子，目前發(fā)現(xiàn)，Gli包括Gli1、Gli2和Gli3，其中Gli1是轉(zhuǎn)錄激活因子，其活化能夠誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄，是Hh信號通路激活的重要標(biāo)志。Hedgehog信號通路在肝癌中異常表達，Che等［7］發(fā)現(xiàn)Hedge-hog信號通路中GLi1在HCC的發(fā)生發(fā)展中扮演重要角色，Huang等［8］發(fā)現(xiàn)，使用環(huán)靶明或KAAD－環(huán)靶明抑制SMO，能抑制Hep3B、Huh7以及PLC／PRF／5細胞的增殖，促進其凋亡。

雖然Hedgehog信號通路與HCC的發(fā)生密切相關(guān)，但該通路到底通過何種機制促進腫瘤的發(fā)生發(fā)展仍不清楚。Chen等［9］發(fā)現(xiàn)抑制Gli1后，MMP-2、9上調(diào)，并阻斷EMT、VEGF從而抑制肝癌細胞的轉(zhuǎn)移和侵襲；同樣沉默GLi2后，能夠下調(diào)cyclinD1、cy- clinE2，上調(diào)p21-WAF1，從而抑制細胞增殖；同時降低c-FLIP和Bcl-2，激活Caspase-8／9和Caspase-3，誘導(dǎo)核糖聚合酶（PARP）裂解，促進凋亡［10］。最新研究發(fā)現(xiàn)，丙酮酸激酶同工酶M2（PKM2）、腺苷酸活化蛋白激酶（AMPK）及激酶蛋白CK2α能夠調(diào)節(jié)GLi1，共同參與了肝癌的發(fā)展進程［11－12］。Hedgehog信號通路在HCC中的作用已被廣泛證實，其與其它信號通路的關(guān)聯(lián)值得我們進一步探討，同時也為我們提供了新的抗腫瘤藥物研發(fā)方向。

近年來，人們越來越多的將抗腫瘤藥物著眼于天然藥物的開發(fā)。自蜂毒素被發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤作用以來，其作用機制一直在不斷探索。蜂毒素能夠通過抑制NF-κB和AP-1依賴的MMP-9的表達抑制腫瘤的侵襲，并通過阻斷VEGFR2／COX-2介導(dǎo)的MAPK信號通路和抑制ERK和mTOR通路抑制HIF-1α／VEGF表達抑制腫瘤生長［13］。蜂毒素對肝癌也有明確的作用，蜂毒素能明顯抑制人肝癌細胞裸鼠移植瘤的生長，其作用機制可能與下調(diào)IL-8和VEGF的表達，抑制腫瘤血管生成有關(guān)；蜂毒素還可通過激活CaMKII-TAK1-JUK／P38和抑制NF-κB誘導(dǎo)HCC的凋亡［14］。本實驗通過不同給藥濃度的蜂毒素對SHH、PTCH1、SMO、GLi1的作用證實，蜂毒素可能通過Hedgehog信號通路抑制人肝癌HepG2細胞增殖，促進其凋亡。

HDACs為組蛋白去乙酰化酶，其主要的功能是從N-乙酰賴氨酸中刪除乙酰基團。研究顯示異常表達的HDAC2能夠調(diào)節(jié)人肝癌細胞增殖，并影響腫瘤細胞周期。Gianluca等［15］證實Gli1和Gli2是被乙酰化了的蛋白，HDACs介導(dǎo)的去乙酰化作用能夠促進GLi1和GLi2的激活，沉默HDAC能抑制Hedgehog信號通路誘導(dǎo)的腫瘤細胞增殖。Noh等［16］發(fā)現(xiàn)異常表達的HDAC2能調(diào)節(jié)G1／S期細胞周期蛋白，影響HCC的增殖；同時研究發(fā)現(xiàn)在腫瘤遷移侵襲過程中調(diào)節(jié)細胞分化的脫乙酞酶的抑制劑（HDACi）帕比司他在HepG2、HPe3B細胞中的劑量與SHH、SMO、Pct．、GLi1的表達負相關(guān)［17］。本研究中Western blot及qRT-PCR結(jié)果顯示，與空白對照組比較，蜂毒素能降低HDAC2的表達水平，同時實驗結(jié)果顯示Hedgehog信號通路中GLi1水平明顯降低，與Gianluca結(jié)果一致，提示蜂毒素可能是通過調(diào)控HDAC2影響Hedgehog信號通路。

本實驗從細胞分子水平證實蜂毒素對人肝癌細胞HepG2的增殖和凋亡具有調(diào)控作用，其作用可能和抑制Hedgehog信號通路相關(guān)，并且發(fā)現(xiàn)蜂毒素能夠抑制組蛋白去乙酰化酶2（HDAC2），且呈劑量負

相關(guān)，提示Hedgehog信號通路可能受乙酰化影響，蜂毒素對HDAC2作用及后者對Hedgehog信號通路的調(diào)控和具體機制，后期將進一步深入研究。

參考文獻：

［1］ Feng G S．Conflicting roles of molecules in hepatocarcinogenesis：paradigm or paradox［J］．Cancer Cell，2012，21（2）：150－4．

［2］ Han S M，Kim J M，Park K K，et al．Neuroprotective effects of melittin on hydrogen peroxide-induced apoptotic cell death in neu-roblastoma SH-SY5Y cells［J］．BMC Complement Alternat Med，2014，14：286．

［3］ Lee W R，Kim K H，An H J，et al．The protective effects of melit-tin on Propionibacterium acnes-induced inflammatory responses in vitro and in vivo［J］．J Invest Dermatol，2014，134（7），1922－30．

［4］ Zheng X，Zeng W，Gai X，et al．Role of the Hedgehog pathway in hepatocellular carcinoma（review）［J］．Oncol Rep，2013，30（5）：2020－6．

［5］ Chung J H，Larsen A R，Chen E，et al．A PTCH1 homolog tran-scriptionally activated by p53 suppresses hedgehog signaling［J］．J Biol Chem，2014，289（47）：33020－31．

［6］ Jeng K S，Sheen I S，Jeng W J，et al．Blockade of the sonic Hedgehog pathway effectively inhibits the growth of hepatoma in mice：An in vivo study［J］．Oncol Lett，2012，4（6）：1158－62．

［7］ Che L，Yuan Y H，Jia J，Ren J．Activation of sonic Hedgehog signaling pathway is an independent potential prognosis predictor in human hepatocellular carcinoma patients［J］．Chin J Cancer Res，2012，24（4）：323－31．

［8］ Huang S，He J，Zhang X，et al．Activation of the Hedgehog path-way in human hepatocellular carcinomas［J］．Carcinogenesis，2006，27（7）：1334－40．

［9］ Chen J S，Li H S，Huang J Q，et al．Down-regulation of Gli-1 in-hibits hepatocellular carcinoma cell migration and invasion［J］．Mol Cell，2014，393（1－2），283－91．

［10］Zhang D，Liu J，Wang Y，et al．shRNA-mediated silencing of Gli2 gene inhibits proliferation and sensitizes human hepatocellular carcinoma cells towards TRAIL-induced apoptosis［J］．J Cell Bio-chem，2011，112（11），3140－50．

［11］Wu D，Sui C，Meng F，et al．Stable knockdown of protein kinase CK2-alpha（CK2alpha）inhibits migration and invasion and in-duces inactivation of Hedgehog signaling pathway in hepatocellular carcinoma HepG2 cells［J］．Acta Histochemica，2014，116（8）：1501－8．

［12］Xu Q，Liu X，Zheng X，et al．PKM2 regulates Gli1 expression in hepatocellular carcinoma［J］．Oncol Lett，2014，8（5）：1973－9．

［13］Shin J M，Jeong Y J，Cho H J，et al．Melittin suppresses HIF-1alpha／VEGF expression through inhibition of ERK and mTOR／p70S6K pathway in human cervical carcinoma cells［J］．PloS One，2013，8（7）：e69380．

［14］Wang C，Chen T，Zhang N，et al．Melittin，a major component of bee venom，sensitizes human hepatocellular carcinoma cells to tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligand（TRAIL）-induced apoptosis by activating CaMKII-TAK1-JNK／p38 and in-hibiting IkappaBalpha kinase-NFkappaB［J］．J Biol Chem，2009，284（6）：3804－13．

［15］Canettieri G，Di Marcotullio L，Greco A，et al．Histone deacety-lase and Cullin3-REN（KCTD11）ubiquitin ligase interplay regu-lates Hedgehog signalling through Gli acetylation［J］．Nat Cell Bi-ol，2010，12（2）：132－42．

［16］Noh J H，Jung K H，Kim J K，et al．Aberrant regulation of HDAC2 mediates proliferation of hepatocellular carcinoma cells by deregulating expression of G1／S cell cycle proteins［J］．PloS One，2011，6（11）：e28103．

［17］黃繼錦，李長福．Hedgehog信號通路在肝癌中的研究進展［J］．中醫(yī)藥現(xiàn)代遠程教育，2014，12（7）：156－8．

［17］Huang J J，Li C C．Hedgehog pathway in human hepatocellular carcinomas［J］．Chin Med Mod Distance Educat China，2014，12 （7）：156－8．

Effect of melittin on proliferation and apoptosis of human HepG2 cells

SHEN Wen-wen，ZHAO Bin，HUANG Cheng，MENG Xiao-ming，CHEN Zhao-lin，WU Xiao-qin，LI Jun
（School of Pharmacy，Anhui Medical University，Institute of Liver Diseases of Anhui Medical University，Anhui Institute of Innovative Drugs，Hefei 230032，China）

Abstract：Aim To observe the effect of melittin on human hepatocelluar carcinoma HepG2 cell prolifera-tion in vitro and its further mechanisms．Methods The capacity of cellular proliferation and apoptosis was measured with the 3-（4，5-dimethylthiazol-2-yl）-2，5-diphenyltetrazolium bromide（MTT）assay，Hoechst 33258 assay and Annexin V-FITC／PI assay．The mR-NA expression of Shh，PTCH1，SMO，GLi1 and HDAC2 was performed by qRT-PCR．And the protein expression of Shh，PTCH1，SMO，GLi1 and HDAC2 was assessed by western blotting．Results Our study found that melittin effectively inhibited cell prolifera- tion and promoted cell apoptosis in vitro using MTT method and Flow cytometry．The mRNA and protein expression of Shh，PTCH1，SMO，GLi1 and HDAC2 were obviously decreased after treated with various con-centrations of melittin for 48h in HepG2 cells．Conclu-sions Taken together，our data suggest that melittin could inhibit cell proliferation and promote cell apopto-sis，reduce the level of HDAC2 and down-regulate the Hedgehog signaling pathway in this process simultane-ously．

Key words：melittin；HDAC2；Hedgehog signaling pathway；proliferation；apoptosis；HepG2 cells

作者簡介：沈文文（1988－），男，碩士，研究方向：抗炎免疫藥理學(xué)，E-mail：aswen1988＠163．com；李 俊（1960－），男，博士，教授，博士生導(dǎo)師，研究方向：臨床藥理學(xué)，抗炎免疫藥理學(xué)，通訊作者，Tel：0551-65161001，E-mail：lijun＠ahmu．edu．cn

基金項目：國家自然科學(xué)基金資助項目（No 81273526）；博士點基金項目（No 20123420120001）；安徽省教育廳基金資助項目（No KJ2012A156）；安徽省自然科學(xué)基金項目（No 1308085MH145）；安徽醫(yī)科大學(xué)基金項目（No XJ201118）

收稿日期：2015－04－27，修回日期：2015－05－29

文獻標(biāo)志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1222－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．009