異甘草素對大鼠C6膠質瘤細胞增殖和分化的影響

李雅娟，甘 露，王占洋，邱理紅，營營，張 紅，馬成俊，李 忌，孫喜靈，王振華

（1．石河子大學藥學院，新疆石河子 832005；2．中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州 730000；3．煙臺大學生命科學學院，線粒體與健康衰老研究中心，山東煙臺 264005；4．濱州醫學院中西醫結合學院，山東煙臺 264003）

異甘草素對大鼠C6膠質瘤細胞增殖和分化的影響

李雅娟1，甘 露2，王占洋1，邱理紅1，營營3，張 紅2，馬成俊3，李 忌3，孫喜靈4，王振華3

（1．石河子大學藥學院，新疆石河子 832005；2．中國科學院近代物理研究所，甘肅蘭州 730000；3．煙臺大學生命科學學院，線粒體與健康衰老研究中心，山東煙臺 264005；4．濱州醫學院中西醫結合學院，山東煙臺 264003）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R329．24；R394.2；R730.264；R739.41

摘要：目的 研究異甘草素對大鼠C6膠質瘤細胞增殖和分化的影響。方法 采用磺酰羅丹明B（SRB）比色法和克隆形成實驗考察異甘草素對C6膠質瘤細胞增殖抑制作用；Giemsa染色觀察細胞形態學變化；半定量RT-PCR、Western blot鑒定細胞分化相關基因及蛋白表達水平。結果 大鼠C6膠質瘤細胞經異甘草素誘導后，以濃度依賴性抑制細胞增殖（P＜0.01）；光鏡觀察到異甘草素誘導前的C6膠質瘤細胞呈兩極長梭形或多角形，胞質多，胞突短；而誘導后細胞突起數目不同程度增多，細胞形態變細變長。誘導前克隆形成出現早，數量多，直徑大，克隆形成率高；異甘草素處理組克隆形成率降低，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。RT-PCR、Western blot結果顯示，異甘草素誘導后C6細胞GFAP mRNA和蛋白表達均明顯上升（P＜0.01）。結論 異甘草素能抑制大鼠C6膠質瘤細胞的增殖，并能誘導C6細胞分化。

關鍵詞：異甘草素；C6膠質瘤；增殖；分化；克隆形成；吉姆薩染色；星形膠質細胞；GFAP

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．023．html

膠質瘤（glioma）屬于神經上皮源性腫瘤，是顱內最常見的原發性腫瘤，約占顱內腫瘤的60%［1］。在我國，膠質瘤的發病率居顱內腫瘤之首，是預后較差的腫瘤之一，病死率高。盡管目前臨床上采用傳統的外科手術，內科化療，先進的放射治療手段以及應用各種新型的抗癌藥物，但膠質瘤患者預后效果不佳，患者多于明確診斷后1年內死亡［2］。因此，探索新的、更加有效的膠質瘤的治療方案及方法具有十分重要的意義。

Pierce等［3］于1961年首次提出腫瘤的誘導分化治療的理論。該理論認為腫瘤細胞在一定條件下，如應用誘導分化藥物等，可以繼續分化，甚至達到終末分化，成為正常細胞，從而治愈腫瘤。尋找一種新的低毒的天然的抗腫瘤成分，以增強常規的抗腫瘤藥物治療腫瘤臨床效果是當前醫學研究的重點和難點之一。

異甘草素（isoliquiritigenin，ISL）是甘草中的一種黃酮類化合物，具有廣譜抗腫瘤［4］、抗氧化［5］、清自由基［6］等多種藥理學作用。也有文獻報道，ISL可能通過非競爭性鈣拮抗作用松弛豚鼠氣管平滑肌［7］，可改善反復腦缺血／再灌注小鼠認知功能障礙［8］。大鼠C6膠質瘤細胞，它被認為是較完美的研究神經膠質細胞發育毒性的實驗模型［9］。膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）是星形膠質細胞的標志蛋白［10］，通過檢測它們的表達水平研究ISL 對C6細胞的分化影響。本課題組相關研究表明，ISL可抑制白血病和黑色素瘤細胞增殖，并誘導其分

化［11－12］。由于ISL對中樞神經系統腫瘤作用的研究還少見報道，同時亦有研究表明其在神經保護方面亦有一定作用，因此，本實驗選用ISL為研究對象，研究其對大鼠C6腦膠質瘤細胞的誘導分化作用。

1　材料與方法

1．1材料與試劑 大鼠C6神經膠質瘤細胞購自中國典型培養物保藏中心（武漢），由煙臺大學線粒體與健康衰老中心傳代保存；DMEM培養基、胎牛血清（fetal bovine serum，FBS），美國Gibco公司；ISL（純度98%），江西本草天工科技有限公司；磺基羅丹明B （SRB），上海晶純生化科技股份有限公司；Giemsa干粉，北京拜爾迪生物技術有限公司；逆轉錄試劑盒，TaKaRa公司；引物合成，上海生工；GFAP抗體，美國CST公司。

1．2儀器與設備 AE31型熒光倒置顯微鏡，Motic公司；SpectraMax Paradigm型多功能酶標儀，美國美谷分子儀器有限公司；垂直電泳儀及轉膜系統，北京六一儀器廠；PCR擴增儀，美國Bio-Rad公司；Tanon 5500凝膠成像系統，上海天能公司。

1．3細胞培養及分組 C6細胞培養于含10%FBS、100 kU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素的DMEM培養基中，置于37℃、5%CO2、飽和濕度的培養箱中培養傳代。

異甘草素儲備液：以DMSO溶解ISL，配成濃度為100 mmol·L－1的貯存液，－20℃保存備用。使用前以含1%FBS的DMEM培養液稀釋，使ISL的終濃度為20、30、40 μmol·L－1。

1．4SRB法測定異甘草素對細胞生長的抑制效應異甘草素對C6細胞生長抑制效應測定采用SRB法。取對數生長期細胞，消化計數，調整細胞密度至5× 104·mL－1，接種于96孔板中，每孔體積200 μL，接種24 h后，棄去培養基，分別加入含終濃度為0、20、30 和40 μmol·L－1異甘草素的培養基（含1%FBS），于37℃培養72 h。細胞培養結束后，取出培養板，每孔加入50 μL預冷的三氯乙酸（TCA）溶液（30%，W／V）固定細胞，TCA的終濃度為10%，然后在4℃冰箱中放置1 h。各孔用去離子水洗滌5遍，自然晾干后，每孔加入100 μL 0.4%的SRB溶液（1%的乙酸配制），靜置染色30 min后，倒掉染液，用1%乙酸洗滌5遍，去除未結合的染料，空氣中干燥后用100 μL Tris堿液（10 mmol·L－1，pH＝10.5）溶解，在微孔板振蕩器上振蕩20 min，多功能酶標儀在540 nm波長下測量各孔的吸光值。按下式計算藥物對細胞增殖的抑制率：

抑制率／%＝（對照組OD值－給藥組OD值）／對照組OD值×100%

1．5Giemsa染色觀察細胞形態 取對數生長期細胞，用0.25%胰蛋白酶消化，制成單細胞懸液，接種于含滅菌蓋玻片的6孔培養板中，待細胞貼附到蓋玻片后，吸去培養液，分別加入含不同濃度異甘草素的培養基，對照組用含1%FBS的DMEM培養基，培養72 h，取出蓋片，PBS洗滌2次，用甲醇固定10 min，PBS洗滌2次，滴加Giemsa染液顯色5 min，自然晾干，二甲苯透明，甘油封片；于顯微鏡下觀察并拍照。光鏡下觀察細胞核呈紫紅色或藍紫色，細胞質成粉紅色。

1．6平板克隆形成實驗 取對數生長期C6細胞接種于培養瓶，用不同濃度的異甘草素處理72 h，棄去培養液，用預冷PBS洗2遍，用0.25%胰蛋白酶消化并吹打成單個細胞，把細胞懸浮于含10%FBS的DMEM培養液中備用。將細胞接種于6孔板中，每孔200個細胞。置37℃、5%CO2及飽和濕度的培養箱，靜置培養10 d。終止培養，棄去上清，PBS漂洗2次，甲醇固定10 min，棄固定液，Giemsa染色液染30 min，PBS沖盡多余染液，空氣干燥。在倒置相差顯微鏡下觀察集落形成情況并拍照。拍照并計算肉眼可見的集落數，最后計算克隆形成率。

1．7RT-PCR檢測GFAP mRNA表達 參照文獻［13］進行，檢測異甘草素處理后GFAP mRNA的表達情況。取對數生長期的C6細胞消化制成細胞懸液，接種于中號培養瓶中，置于5%CO2、37℃恒溫培養箱中過夜，待細胞貼壁。吸去培養液，換用含有不同濃度異甘草素的新鮮培養基，繼續培養72 h后，用TRIzol試劑提取總RNA。逆轉錄反應體系擴增反應條件：94℃預變性3 min，94℃變性40 s，不同引物選擇不同溫度，退火45 s，72℃延伸1 min，循環30次后于72℃延伸10 min，得PCR產物，進行瓊脂糖凝膠電泳分離分析。用Tanon 5500凝膠成像系統拍照并分析產物條帶的相對光密度值。表1為實驗所需的引物序列：

Tab 1 The designed primers and reaction condition for detecting different genes

1．8Western blot檢測GFAP表達 取對數生長期

C6細胞接種于培養瓶，用不同濃度的異甘草素處理72 h，棄去培養液，用預冷PBS洗2遍，加入RIPA細胞裂解液，冰上裂解30 min，用細胞刮刀收集細胞，12 000×g離心30 min。取上清，BCA法測定裂解液中的蛋白濃度。取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE電泳，300 mA電轉移120 min至PVDF膜，TBST漂洗3次，將PVDF膜放入含5%BSA的封閉液中，置于水平搖床，室溫孵育120 min。取出PVDF膜，放入含有5%BSA的TBST的小鼠GFAP單克隆抗體一抗中（1 ∶1 000），4℃冰箱孵育過夜，再用TBST漂洗3次，與辣根過氧化物酶標記二抗（1∶5 000）室溫孵育2 h，漂洗后，用Tanon 5500凝膠成像系統拍照并分析蛋白產物條帶的相對光密度值。

2　結果

2．1異甘草素濃度依賴性抑制C6神經膠質瘤增殖不同濃度ISL處理C6細胞72 h，20 μmol·L－1ISL處理即表現出對C6細胞增殖的抑制作用，隨著ISL濃度的增加，存活細胞數目逐漸減少，ISL對細胞的抑制作用逐漸增強，呈濃度依賴性。

Fig 1 Effects of ISL on proliferation of C6 cells

2．2異甘草素對C6細胞的形態學的影響 光鏡下觀察，發現對照組膠質瘤細胞多數呈兩極長梭形，有的呈多角形，胞質多，胞突短；而72 h ISL處理組細胞突起數目不同程度增多，細胞形態逐漸變細變長，ISL 20 μmol·L－1處理組（Fig 2）中細胞形態即開始出現變化，細胞胞體變圓，胞體兩端突起變細變長，但部分細胞突起細而短，有的細胞突起長度可達細胞胞體的數倍，與對照組相比，陽性延展細胞數差異具有顯著性；隨著異甘草素處理濃度的增加、作用時間的延長，陽性延展細胞越來越多，72 h ISL處理組可見細胞突起明顯變長，ISL 40 μmol·L－1處理組細胞形態學改變較其他組相比最明顯（Fig 2A）。經吉姆薩染色后顯微鏡下觀察，大鼠C6膠質瘤細胞胞質豐富，呈淡藍色或深藍色，有非特異性嗜天青顆粒（呈紫紅色），兩極呈短梭形，胞突短，胞質豐富，如圖2所示，ISL處理后，細胞胞質變少，胞突明顯變細變長，胞質呈紫紅色。

Fig 2 Morphological transformation induced by ISL in C6 glioma cells（×200）

2．3異甘草素對C6細胞的克隆形成率的影響 ISL誘導C6細胞分化后，神經膠質瘤C6細胞會向星型膠質細胞分化，因而集落生成能力降低。對照組克隆形成出現早，數量多，直徑大，克隆形成率高（36%），20 μmol·L－1ISL處理組克隆形成率為25%，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），40 μmol·L－1ISL處理組克隆形成率為6%，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）。

ISL處理組與對照組相比，其形成的集落的個數明顯少于對照組的克隆數，其惡性程度降低，增殖能力下降，集落形成能力也減弱（Fig 3）；統計細胞形成的平均集落數，可以看出，對照組細胞的克隆形成率36%，明顯多于40 μmol·L－1ISL處理組克隆形成率16%；ISL處理組最大與最小集落較對照組相比均明顯變小，并且大多數細胞不能形成明顯的集落，說明ISL使C6細胞分化。

Fig 3 ISL significantly reduced number of colony formation in C6 cells

2．4異甘草素對C6細胞的GFAP mRNA表達的影響 采用RT-PCR方法，分析不同濃度的ISL對細胞分化相關蛋白GFAP mRNA表達情況的影響。結果如Fig 4所示，不同濃度的ISL（20、30、40 μmol· L－1）作用72 h后，能夠誘導細胞分化相關蛋白GFAP mRNA上調，在40 μmol·L－1作用時，GFAP mRNA表達水平最高，與對照組相比差異有顯著性（P＜ 0.01）。

Fig 4 ISL significantly increased expression of GFAP mRNA in C6 glioma cells（n＝3）

Fig 5 ISL significantly increased expression of GFAP protein in C6 cells

2．5異甘草素對C6細胞GFAP蛋白表達的影響采用Western blot方法，分析不同濃度的ISL對細胞分化相關蛋白GFAP表達情況的影響。結果如Fig5

所示，不同濃度的ISL（20、30、40 μmol·L－1）作用72 h后，均能夠誘導細胞分化相關蛋白GFAP上調，與對照組相比差異均具有統計學意義（P＜0．01）。在40 μmol·L－1作用時，GFAP表達水平最高。

3　討論

膠質瘤是腦腫瘤中發病率較高的一種腫瘤，其手術治療效果不佳，容易復發，因此是神經腫瘤治療的一個難點和熱點。為了更好地探索膠質瘤的治療策略，國內外學者探索從傳統的中醫藥中尋找解決的辦法。誘導分化是指惡性腫瘤在體內外分化誘導劑存在下，重新分化向正常方向逆轉的現象。大量研究報道和體外實驗表明，在某些誘導分化劑作用下，腫瘤細胞可被誘導分化，出現類似正常細胞的表型或恢復正常細胞的某些功能。

ISL是從中藥材甘草中提取和分離得到的黃酮類化合物，在藥用植物中廣泛存在，研究表明其有多種藥理學活性，是甘草所提取出來的黃酮類成分中研究較多的重要化合物之一［14］。異甘草素對其他系統腫瘤的抑制作用已經陸續有相關報道，而對中樞神經系統腫瘤作用的研究少見報道，所以本實驗用ISL對膠質瘤細胞C6進行研究，探討ISL的增殖抑制及誘導分化作用。

SRB比色法，主要用來檢測細胞增殖情況。實驗分別測定了20、30、40 μmol·L－1的異甘草素，在72 h 對C6細胞活性的影響。如Fig 1所示，ISL低劑量組（20 μmol·L－1）、24 h即開始表現出對C6細胞生長有抑制作用，隨著劑量的增加、ISL的抑制作用也加大，呈劑量效應（P＜0.01）。

本實驗對C6細胞形態學觀察顯示，異甘草素在濃度為20 μmol·L－1時就對C6有抑制作用，ISL處理72 h后，對膠質瘤細胞的抑制作用呈濃度依賴性，倒置顯微鏡下觀察可見，與對照組相比細胞兩端變細變長的增多。

克隆形成率反映細胞群體依賴性和增殖能力兩個重要性狀，形成克隆的細胞必為貼壁和有增殖活力的細胞。如Fig 3所示，對照組克隆形成出現早，數量多，直徑大，克隆形成率高，而ISL處理組克隆形成率低，與對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01），且絕大多數不能形成有效克隆。

GFAP是星形膠質細胞及其腫瘤的特異標志物，是膠質細胞特有的細胞骨架蛋白，它的表達對于維持膠質細胞的正常形態以及調節細胞的生長速度具有重要的作用，是判斷膠質細胞分化程度的一個重要標準之一，它與分化程度呈正相關［15］。本實驗采用檢測RT-PCR、Western blot鑒定ISL對C6的誘導分化作用，如Fig 4和5所示，ISL對C6細胞作用72 h后，mRNA和蛋白水平的實驗結果均顯示GFAP的表達隨著ISL的作用劑量增加而增加，特別是40 μmol·L－1ISL處理組增加最明顯（P＜0.01）。

課題組前期研究表明，NADPH氧化酶活化及活性氧生成介導了ISL誘導的HL-60細胞分化［16］。本研究證實異甘草素可誘導C6細胞向星形膠質細胞分化，但異甘草素是否通過調控細胞內氧化還原狀態誘導C6膠質瘤分化，有待進一步研究。

綜上所述，異甘草素能抑制大鼠C6膠質瘤細胞的增殖，并能誘導C6細胞分化。本研究以傳統中藥材甘草的活性成分異甘草素作為研究對象，研究其在中樞神經系統腫瘤中的作用，并討論其對細胞增殖和分化的影響，對于異甘草素的開發應用及異甘草素對中樞神經疾病及其他惡性腫瘤的分化治療相關研究提供了一定的理論依據和實踐基礎，對新疆地區的甘草產業的發展有重要意義。

（致謝：本實驗在煙臺大學生命科學學院，線粒體與健康衰老研究中心完成，衷心感謝實驗室全體教師的指導和同學的幫助！）

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Effect of Isoliquiritigenin on C6 glioma cell proliferation and differentiation

LI Ya-juan1，GAN Lu2，WANG Zhan-yang1，QIU Li-hong1，SI Ying-ying3，ZHANG Hong2，MA Cheng-jun3，LI Ji3，SUN Xi-ling4，WANG Zhen-hua3
（1．School of Pharmacy，Shihezi University，Shihezi Xinjiang 832005，China；2．Institute of Modern Physics，Chinese Academy of Sciences，Lanzhou 730000，China；3．Center of Mitochondrion and Healthy Aging，College of Life Sciences，Yantai University，Yantai Shandong 264005，China；4．Shandong Key Laboratory of TCM Heart-spleen Foundation，Binzhou Medical University，Yantai Shandong 264003，China）

Abstract：Aim To investigate the effects of isoliquiri-tigenin（ISL）on C6 glioma cell proliferation and differ-entiation．Methods C6 glioma cells’viability and proliferation were respectively measured by SRB test．Colony formation of C6 glioma cells from different groups was assayed．After culturing the cells from each group，giemsa staining was used to observe cell mor-phology．RT-PCR was applied to detect mRNA expres-sion of GFAP．Western blot was applied to detect the expression of GFAP．Results ISL effectively inhibited the viability of C6 glioma cells when compared with the control group in a concentration-dependent manner（P ＜0.01）．The morphological observation under light mi-croscope showed that：in the control group，most of the undifferentiated C6 cells showed long fusiform and po-lygonal shape．Compared to the control group，the C6 cells treated with ISL revealed alteration in morphology such as astrocytes with smaller smooth，round body and much finer longer，tapering processes．The cloning for-mation rate detection revealed that：the colonies in the control group semerged earlier and were larger than those experimental ones，the cloning formation rate was higher，while almost no effective cells colony emerged in ISL treated groups（P＜0.01）．Western blot and RT-PCR analysis showed that GFAP expression in the ex-perimental groups increased（P＜0.01）．Conclusion ISL may inhibit the proliferation of C6 glioma cells and induce their differentiation．

Key words：Isoliquiritigenin；C6 glioma cell；prolifera-tion；differentiation；colony formation；giemsa staining；astrocyte；GFAP

作者簡介：李雅娟（1989－），女，碩士生，研究方向：分子藥理學，E-mail：yajuanli＠sina．cn；王振華（1973－），男，博士，副教授，研究方向：自由基生物醫學，通訊作者，E-mail：zhenhuawang＠tom．com

基金項目：國家自然科學基金面上項目（No 11175222，21372190）；石河子大學重大科技攻關計劃項目（No gxjs2012-zdgg02）；山東省泰山學者建設工程專項經費（tshw201502046）；教育部新世紀優秀人才支持計劃（NCET-10-0967）

收稿日期：2015－03－12，修回日期：2015－05－28

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1298－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．023