染料木素拮抗對氧磷誘導的大鼠胸主動脈組織p22phox表達上調

劉玉玲，汪煜華，張秀芹，李冬花，黃紅林

（1．湖南省高等學校藥物蛋白質組學重點實驗室，南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001；2．婁底市衛生學校，湖南婁底 417000）

染料木素拮抗對氧磷誘導的大鼠胸主動脈組織p22phox表達上調

劉玉玲1，2，汪煜華1，張秀芹1，李冬花1，黃紅林1

（1．湖南省高等學校藥物蛋白質組學重點實驗室，南華大學藥物藥理研究所，湖南衡陽 421001；2．婁底市衛生學校，湖南婁底 417000）

中國圖書分類號：R-322；R322．121；R595．4；R543.5；R977.6

摘要：目的 探討染料木素是否通過下調p22phox、Nox4的表達，抑制活性氧的生成而拮抗對氧磷損傷的血管內皮功能。方法 取♂SD大鼠胸主動脈。①溶媒對照組：用0.1%的二甲基亞砜（dimethyl sulfoxide，DMSO）處理大鼠胸主動脈30 min；②染料木素（genistein，GST）處理組：GST （100 μmol·L－1）處理大鼠胸主動脈30 min；③對氧磷（paraoxon，PO）處理組：PO（40.5 μmol·L－1）處理大鼠胸主動脈30 min；④PO＋GST處理組：PO（40.5 μmol·L－1）＋GST（100 μmol·L－1）處理大鼠胸主動脈30 min。RT-PCR法檢測各組p22phox、Nox4 mRNA表達的變化；Western blot觀察p22phox和Nox4蛋白表達的變化。結果 較之溶媒對照組，PO處理可使p22phox、Nox4 mRNA及蛋白表達明顯增加；GST處理則使p22phox、Nox4 mRNA及蛋白表達明顯減少；PO＋GST共同處理組，Nox4 mRNA及蛋白表達增加。與PO單獨處理組比較，PO＋GST共同處理組p22phox mRNA及蛋白表達明顯減少。結論 對氧磷可通過上調血管組織p22phox、Nox4 mRNA和蛋白的表達，導致血管內皮氧化損傷；染料木素可下調二者的表達，保護血管內皮。

關鍵詞：染料木素；對氧磷；氧化性損傷；NADPH氧化酶；p22phox；Nox4

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．022．html

氧化應激誘導機體產生大量的活性氧（ROS）。ROS是誘發心血管疾病的潛在危險因素。ROS可降解一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS），并直接滅活NO；ROS還能通過與底物的相互作用，引起內皮細胞損傷，啟動炎癥反應；通過激活核因子-κB（NF-κB）及轉錄活化因子（AP-1）而引發細胞凋亡，并進一步促進損傷的血管內皮處的炎性反應；同時ROS還能誘導血管平滑肌細胞的增殖。所有這些都可能導致血管內皮功能障礙。

體內有多種酶參與了ROS的生成，目前研究表明［1］，NADPH氧化酶在多種因素刺激內皮細胞生成ROS的過程中起主要作用。NADPH氧化酶在體內主要分布于吞噬細胞，另外也分布于血管內皮細胞、平滑肌細胞、心肌細胞、成纖維細胞等非吞噬細胞。近來的研究表明，NADPH氧化酶由6種亞基構成，內皮細胞上有其主要功能亞基Nox4及p22phox亞基的表達。研究發現，異位表達的Nox4可與p22phox結合形成復合物，增加Nox4的穩定性；同時Nox4也能促進p22phox的表達，促進依賴Nox4 的ROS產生［2－3］。

對氧磷（paraoxon，PO）是有機磷酸酯類在體內的活性代謝形式。PO可引起機體產生大量過氧化物及氧自由基，抑制對氧磷酶-1（PON1）的過氧化物酶樣作用，抑制SOD活性，誘發機體氧化應激，導致血管內皮細胞損傷。我們早期通過離體血管環實驗也證實了PO可導致大鼠胸主動脈內皮依賴性舒張功能（EDR）損傷，引起血管舒縮功能異常［4］。

染料木素（genistein，GST）為一種植物雌激素，廣泛存在于豆科植物中。很多研究都證實，GST具有抗氧化活性，可對抗DNA氧化損傷［5－6］。GST具有多羥基酚結構，可直接與超氧陰離子等自由基結合，抑制氧自由基反應及脂質的過氧化反應；GST可升高SOD的活性、谷胱甘肽（glutathione，GSH）水平，并上調谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）的水平和活性，加快氧自由基的清除［7－8］；抑制NADPH氧化酶p22phox亞基的表達，抑制ROS的產生［9］。GST的抗氧化作用可避免或減輕血管內皮細胞的氧化損傷，維持血管內皮的正常功能。本實驗室早期研究發現，GST可明顯改善PO誘導的大鼠胸主動脈內皮依賴性舒張功能異常，維持血管正常舒縮功能［4］。

綜上所述，PO引起機體氧化應激，造成血管內皮細胞氧化損傷，血管正常結構和功能受損。GST則具有抗氧化作用，減低氧化應激對血管內皮造成的損傷。結合本實驗室早期大鼠胸主動脈內皮依賴

性舒張功能的實驗結果，筆者推測GST通過其抗氧化作用對抗PO對血管功能的損傷。本實驗旨在于探討PO氧化損傷血管內皮，導致血管內皮功能失調及GST抗氧化、保護血管內皮功能，是否均與NADPH氧化酶分布在血管內皮上的p22phox與Nox4亞基的表達水平相關。本課題的研究將為有機磷酸酯類農藥誘發心血管疾病的發生機制及GST對此類疾病可能的防治提供理論參考及實驗依據。

1　材料與方法

1．1材料

1．1．1動物與試劑 ♂SD大鼠20只，體質量220 ～280 g，南華大學實驗動物中心提供。對氧磷（Dr．Ehrenstorfer GmbH）；染料木素（杭州浙大泛科化工有限公司）；Nox4、p22phox引物［生工生物工程（上海）有限公司］；β-actin（235bp）引物［英濰捷基（上海）貿易有限公司］；β-actin（394bp）引物（上海捷倍思基因技術有限公司）；抗p22phox鼠單克隆抗體（Santa Cruz Biotechnology）；抗Nox4兔單克隆抗體（Abcam）；抗β-actin鼠單克隆抗體（北京康為世紀生物技術有限公司）；其余試劑均為進口或國產生物試劑。對氧磷、染料木素均用0．1%的DMSO溶解后，再用去離子水稀釋至所需濃度。

1．1．2儀器 pH計（MP220型，METTLER TOLE-DO）；高速低溫離心機（5810R型，Eppendorf）；紫外－可見分光光度計（UV2450型，SHIMADZU）；PCR儀、Mini-Protean垂直板電泳槽、濕轉儀（Bio-Rad）；凝膠成像系統（Tanon）；瓊脂糖水平電泳槽（北京六一儀器廠）；酶標儀（ELX 800，Bio-TEK INSTRU-MENTS．INC）。

1．2方法

1．2．1模型建立 ♂SD大鼠，頸椎脫臼處死，取出胸主動脈，置于實驗當天配制的充氧（95%O2／5%CO2）的冰Kreb’s液中［4℃，Kerb′s液用高壓處理后的0.1%焦碳酸二乙酯（DEPC）水配制，調pH 7.2～7.4，于超凈工作臺濾過除菌］，剝離周圍結締組織，將胸主動脈移置含10 mL Kerb′s液的安瓿瓶內，37℃恒溫，同時通入95%O2／5%CO2混合氣體。實驗設4組：①溶媒對照組：加入終濃度0.1% DMSO；②GST處理組：加入終濃度100 μmol·L－1的GST；③PO處理組：加入終濃度40.5 μmol·L－1的PO；④PO＋GST處理組：加入終濃度40.5 μmol ·L－1的PO＋終濃度100 μmol·L－1的GST。各組均于37℃下孵育血管30 min，取出，用冰PBS沖洗（0.1%DEPC水配制并高壓），置于－80℃冰箱保存備用。

1．2．2RT-PCR檢測大鼠胸主動脈p22phox和Nox4 mRNA的表達 各組標本分置于各研缽中，加入液氮，于冰上研磨勻漿后，按照RNA提取試劑盒說明提取組織總RNA。取適量總RNA與6×load-ing buffer按5∶1的比例混勻后，于110 V恒壓下在2．0%的瓊脂糖凝膠中電泳，于凝膠成像系統中觀察電泳結果，若可見28S、18S、5S（此條帶也有可能降解）條帶，且28S條帶亮度是18S條帶亮度2倍左右，提取的總RNA合格，可以用于后續實驗。將提取的總RNA稀釋，分別于260 nm、280 nm處測定其吸光度（A），計算A260／A280，比值在2左右時，說明提取的總RNA質量合格；根據A260計算各組RNA濃度。根據計算所得各組RNA濃度，取等質量1.5 μg RNA按逆轉錄試劑盒說明的實驗程序完成各組RNA逆轉錄，合成互補脫氧核糖核酸（cDNA），并以其作為模板進行PCR擴增。各引物序列及PCR反應條件見Tab 1，各組擴增目的基因的同時擴增內參照β-actin。PCR產物在2．0%的瓊脂糖凝膠中電泳，恒壓110 V，上樣量為10 μL，于凝膠成像系統中掃描分析產物條帶。將各組目的基因（p22phox、Nox4）與其內參照（β-actin）擴增條帶的吸光度比值作為目的基因mRNA表達水平的相對指標。

Tab 1 p22phox，Nox4 and β-actin primer sequences and PCR reaction conditions

1．2．3Western blot檢測大鼠胸主動脈p22phox和Nox4蛋白的表達 各組標本分置于各研缽中，加入液氮，研磨勻漿后，按照總蛋白提取試劑盒說明提取組織總蛋白。

1．2．3．1蛋白濃度測定 按照BCA蛋白濃度測定試劑盒說明的實驗步驟，使用酶標儀于570 nm處測定并計算各組蛋白濃度。

1．2．3．2SDS-PAGE凝膠電泳 根據相關抗體說明書，目的基因p22phox蛋白條帶位于26 ku位置處，Nox4蛋白條帶位于63 ku位置處，β-actin蛋白條帶位于43 ku位置處，10%分離膠可較好分離20

～80 ku大小的蛋白質，滿足上述3種蛋白質分離要求。照凝膠配制試劑盒規定步驟制備10%分離膠，37℃恒溫放置30 min，制備濃縮膠，并于37℃恒溫放置40 min，待膠凝固，即可上樣。根據蛋白定量結果，將各組不同濃度蛋白均稀釋至同一濃度，取等質量等體積蛋白（70 μg，22 μL）按4∶1比例與5×蛋白上樣緩沖液（溴酚藍染料預染）混勻（總體積約27.5 μL），100℃煮沸5 min，即可上樣、電泳。濃縮膠的電泳條件為80 V恒壓，觀察蛋白條帶進入分離膠后即調節電壓至120 V，待蛋白Marker各條帶跑開，蛋白條帶接近凝膠底部時，即可停止電泳。

1．2．3．3蛋白質轉膜 剪下比膠略小的PVDF膜，置甲醇中活化2 min。盤內倒入適量轉膜液，按轉膜裝置從陰極到陽極的順序，依次放上濾紙、凝膠、PVDF膜、濾紙，每一步均需去除氣泡。接通電源，恒流350 mA，3 h。

1．2．3．4免疫雜交 剪下p22phox、Nox4、β-actin所處位置PVDF膜，用TBST洗滌2次，5%封閉液封閉，置搖床上振搖1 h，TBST洗滌，分別加入用1%脫脂奶粉稀釋的1∶100 p22phox一抗，1∶200 Nox4一抗，1∶500 β-actin一抗，密封，與膜共振搖1 h，置4℃冰箱過夜。取出PVDF膜，TBST洗滌3次，每次10 min，加入1∶1 500的辣根過氧化物酶標記的相應二抗，密封，于37℃放置30 min，室溫振搖1 h，TBST洗滌3次，每次15 min。按照超敏ECL化學發光試劑盒說明滴加化學發光底物到PVDF膜上，觀察熒光現象，壓片、顯影、定影。定影后的X膠片掃描至計算機，圖像分析系統AlphaIm-ager 2200計算目的條帶的灰度值與內參照β-actin條帶灰度值的比值，作為目的蛋白表達水平的相對指標。

1．3統計學分析 采用統計軟件SPSS 16.0進行統計分析，數據均以±s表示，組間差異比較采用ANOVA及Dunnett-t、S-N-K多重比較。

2　結果

2．1染料木素、對氧磷對大鼠胸主動脈p22phox 和Nox4 mRNA表達的影響 RT-PCR結果顯示（Fig 1），較之溶媒對照組，PO處理引起p22phox mRNA表達明顯上調（P＜0.01）；GST處理導致p22phox mRNA表達下調（P＜0.01）；PO＋GST共同處理對p22phox mRNA表達的影響不大，差異無顯著性。但相對于PO處理組，PO＋GST共同處理可下調p22phox mRNA的表達（P＜0.05）。

RT-PCR結果顯示（Fig 2），相對于溶媒對照組，PO處理引起Nox4 mRNA表達明顯上調（P＜ 0.01）；GST處理導致Nox4 mRNA表達下調（P＜0.05）；PO＋GST共同處理導致Nox4 mRNA表達上調（P＜0.05）。但相對于PO處理組，PO＋GST共同處理對Nox4 mRNA表達的影響不大，差異無顯著性。

Fig 1 RT-PCR results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of p22phox mRNA in rat thoracic aorta tissues（n＝3）

2．2染料木素、對氧磷對大鼠胸主動脈p22phox 和Nox4蛋白表達的影響 Western blot結果顯示（Fig 3），較之溶媒對照組，PO處理引起p22phox蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；GST處理導致p22phox蛋白表達下調（P＜0.05）；PO＋GST共同處理后，較溶媒對照組，p22phox蛋白表達有所增加，但差異無顯著性。但相對于PO處理組，PO＋GST共同處理使p22phox蛋白表達減少（P＜0.05）。

Western blot結果顯示（Fig 4），與溶媒對照組比較，PO處理引起Nox4蛋白表達明顯上調（P＜0.01）；GST處理導致Nox4蛋白表達下調（P＜0.05）；PO＋GST共同處理導致Nox4蛋白表達上調（P＜0.01）；相對于PO處理組，PO＋GST共同處理組Nox4蛋白表達有所降低，但差異無顯著性。

Fig 2 RT-PCR results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of Nox4 mRNA in rat thoracic aorta tissues（±s，n＝3）

Fig 3 Western blot results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of p22phox protein in rat thoracic aorta rings（±s，n＝3）

Fig 4 Western blot results show the effects of genistein and paraoxon on the expression of Nox4 protein in rat thoracic aorta rings（±s，n＝3）

3　討論

心血管疾病目前已成為影響人類健康的頭號疾病，其發病機制和病理過程各異，已經證實血管內皮損傷與心血管疾病的發展密切相關。血管內皮細胞可合成、分泌多種生物活性物質，參與調節血管緊張度、維持血管正常的舒縮功能。血管內皮細胞損傷導致細胞功能障礙、血管正常舒縮功能受損，誘發一系列病理性應激反應的產生。很多心血管疾病的早期誘因均牽涉到血管內皮損傷、血管舒縮功能異常。

有機磷酸酯類（OPs）化合物是目前廣泛使用的一類農藥，OPs侵入機體后，在體內經肝臟P450系統代謝為具有生物活性的PO。少量的PO可進一步被PON1水解失活，隨尿液排出體外。但長期或大量接觸OPs，可導致機體PON1濃度及活性降低［10］，PO水解排出減少。PON1具有抗氧化作用，可抑制血漿氧化物形成并清除血漿氧化物。體內PO的蓄積可誘發氧化應激，損傷血管內皮，誘發心血管疾病。已有研究表明［11］，給兔長期灌胃敵百蟲，可降低兔血清及肝PON1的活性，加速兔動脈粥樣硬化的形成；Prozorovskiǐ等［12］研究也發現OPs可導致內皮細胞變形，并損傷內皮細胞功能；李鵬等［13］實驗表明，對氧磷（0.036 3～36.3 μmol·

L－1）與人臍靜脈內皮細胞（HUVEC）及血管組織共孵30 min，濃度和時間依賴性地增加了單層內皮細胞的通透性，內皮細胞活力下降，細胞萎縮；大鼠血管組織及細胞培養液中丙二醛（MDA）的含量增高、SOD活性降低、一氧化氮（NO）含量減少，血管內皮細胞損傷；且PO可濃度依賴性及時間依賴性抑制血管內皮依賴性舒張功能。

本實驗室前期實驗證實了PO可濃度依賴性（0.004 05～40.5 μmol·L－1）抑制大鼠胸主動脈EDR功能［4］。但PO損傷內皮細胞導致心血管疾病的發生除了與其直接毒性刺激作用及抑制機體抗氧化酶活性有關外，是否還涉及到內皮細胞ROS生成的主要酶體——NADPH氧化酶，目前尚未見報道。本實驗通過建立大鼠胸主動脈PO損傷模型，檢測NADPH氧化酶在血管組織中的2個主要亞基p22phox、Nox4的表達情況，發現PO能夠上調p22phox、Nox4 mRNA及蛋白的表達。從機體ROS的產生途徑初步探討了PO造成血管內皮損傷的另一可能機制。

目前，實驗室研究、臨床試驗、流行病學統計均表明攝入GST可降低心血管疾病發病率。大量研究資料表明GST具有確切的抗炎、抗氧化、保護血管內皮、維持血管正常的舒縮功能的作用［14］。GST可直接作用于血管平滑肌，濃度依賴性地降低氯化鉀（KCl）誘導的血管收縮［15－16］。文獻報道［17］，連續給予♂糖尿病大鼠GST 31 d，發現在內皮完整的血管環，GST組對KCl、PE誘導的收縮反應明顯低于糖尿病組；對ACh誘導的舒張反應明顯高于糖尿病組。本實驗室早期的實驗也發現GST可明顯抑制PO導致的血管EDR功能損傷［4］。所有這些證據均表明GST調節血管緊張度，保護血管內皮，進而改善血管內皮依賴性舒張功能。

關于GST保護心血管系統的相關機制眾多。GST可降低鼠血漿中TC、LDL-C、TC／HDL-C［10，18］，減輕血管結構與功能的損傷；同時，GST也可抑制TNF-α的下游因子NF-κB表達［19］，快速激活p38β絲裂原蛋白激酶［20］，進而對抗TNF-α誘導的內皮細胞損傷及編程性細胞死亡。然而，GST的抗氧化作用是其保護心血管系統的主要作用機制之一。研究發現，GST可升高機體SOD的活性、GSH水平，并上調GSH-Px的水平和活性，增強機體抗氧化水平［8］；Vera等［21］發現，長期給予自發性高血壓大鼠GST，可抑制NADPH氧化酶活性，降低ROS的產生，改善血管內皮功能紊亂；Xu等［9］也發現GST可下調大鼠p22phox亞基的表達，抑制ROS的產生。但GST對內皮細胞上NADPH氧化酶另一重要的亞基Nox4表達的影響，目前尚未見報道。本研究通過用100 μmol·L－1GST處理大鼠胸主動脈后，觀察血管組織中p22phox、Nox4表達的情況，發現GST可下調p22phox、Nox4的表達。

本實驗室前期實驗已發現，GST與PO共同預處理血管環后，血管環EDR功能較PO單獨處理血管環有了明顯改善［4］，GST與PO對p22phox、Nox4表達的相反的調節作用是否可以解釋這一現象？GST是否可通過下調內皮細胞上NADPH氧化酶相關亞基p22phox、Nox4的表達這一途徑來拮抗PO誘導的內皮細胞氧化損傷？本課題從離體組織器官水平就這些問題展開實驗，發現GST可拮抗PO誘導的大鼠胸主動脈組織p22phox表達上調。對于PO誘導的Nox4表達的上調，GST具有一定拮抗效應，但該效應并不明顯。這可能涉及p22phox、Nox4亞基對PO、GST的敏感性不同，Nox4對PO更為敏感；也可能涉及離體模型（大鼠胸主動脈）的建模時間及建模條件等多方面的原因。

綜上所述，通過對PO與GST對血管內皮的作用及其可能機制的初探性研究，為有機磷酸酯類農藥誘發心血管疾病發生的機制及GST對此類疾病可能的防治提供理論參考及實驗依據。

（致謝：本文實驗部分在南華大學藥物藥理研究所完成。在此衷心感謝導師黃紅林教授及藥物藥理研究所全體老師、同學對本實驗工作的關心、支持和幫助?。?/p>

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Genistein antagonizes paraoxon-induced high expressions of NADPH oxidase p22phox and Nox4 in rat thoracic aorta tissues

LIU Yu-ling1，2，WANG Yu-hua1，ZHANG Xiu-qin1，LI Dong-hua1，HUANG Hong-lin1
（1．Learning Key Laboratory for Pharmacoproteomics of Hunan Province，Institute of Pharmacy and Pharmacology，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China；2．Loudi Health School，Loudi Hunan 417000，China）

Abstract：Aim To investigate whether genistein pro-tects paraoxon-induced vascular endothelial dysfunction through down-regulating p22phox and Nox4 expressions as well as inhibiting the generation of ROS．Methods

In this study，thoracic aortas were isolated from the male Sprague-Dawley（SD）rats and were divided into the following groups：①control group，the thoracic a-ortas were incubated with dimethyl sulfoxide（DMSO，0.1%）for 30 min；②genistein group，the thoracic a- ortas were incubated with genistein（100 μmol·L－1）for 30 min；③paraoxon group，the thoracic aortas were incubated with paraoxon at the concentration of 40．5 μmol·L－1for 30 min；④paraoxon plus genistein groups，the thoracic aortas were incubated with paraoxon（40．5 μmol·L－1）plus genistein（100 μmol·L－1）for 30 min．The expressions of p22phox and Nox4 mRNA were detected by RT-PCR and the protein expressions of p22 phox and Nox4 were detected

by Western blot．Results Compared with the control group，the expressions of p22phox and Nox4 were markedly increased in the paraoxon group．In the genistein group，the expressions of p22phox and Nox4 were significantly repressed．When treated with genistein plus paraoxon，there was a marked increase in the expression of Nox4（P＜0.05），but no signifi-cant difference in the expression of p22phox．The ex-pression of p22phox in the paraoxon plus genistein group was significantly decreased（P＜0.05）as com-pared with paraoxin group，but there was no significant difference in the expression of Nox4．Conclusion Paraoxon may result in oxidative damage of vascular endothelium through up-regulating p22phox and Nox4 expressions，genistein may down-regulate the expres-sions of both and protect vascular endothelium．

Key words：genistein；paraoxon；oxidative damage；NADPH oxidase；p22phox；Nox4

作者簡介：劉玉玲（1978－），女，碩士，主管藥師，講師，研究方向：心血管藥理學，E-mail：18373822991＠163．com；黃紅林（1963－），女，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學，通訊作者，E-mail：huanghonglinhui＠aliyun．com

基金項目：湖南省十二五重點學科建設項目；湖南省中醫藥管理局重點項目資助（No 201314）

收稿日期：2015－05－02，修回日期：2015－06－10

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1292－07

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．022