產后抑郁小鼠模型的構建及越鞠甘麥大棗湯對其抑郁樣行為的影響

夏寶妹，張海樓，薛文達，陳 暢，陶偉偉，吳顥昕，陳 剛

（南京中醫藥大學1．基礎醫學院中醫腦病重點實驗室、2．第一臨床醫學院，江蘇南京 210046）

產后抑郁小鼠模型的構建及越鞠甘麥大棗湯對其抑郁樣行為的影響

夏寶妹1，張海樓1，薛文達1，陳 暢2，陶偉偉1，吳顥昕1，陳 剛1

（南京中醫藥大學1．基礎醫學院中醫腦病重點實驗室、2．第一臨床醫學院，江蘇南京 210046）

中國圖書分類號：R-332；R289．5；R363-332；R714．46

摘要：目的 建立產后抑郁癥（PPD）小鼠模型，評估母鼠產后的異常行為，觀察中藥越鞠甘麥大棗湯對產后抑郁母鼠的快速抗抑郁作用。方法 將32只Balb／c母鼠隨機分為2組，空白對照組不給予任何刺激，模型組小鼠給予慢性束縛刺激。3周后予模型組小鼠♀♂合籠交配懷孕，于分娩后3周檢測母鼠行為學，包括蔗糖消耗測試（sucrose preference test，SPT）、強迫游泳測試（forced swimming test，FST）及陌生環境攝食實驗（novelty suppressed feeding test，NSFT），以評價造模是否成功。造模成功后，模型組單次給予越鞠甘麥大棗湯（越甘組），空白對照組和模型組予以生理鹽水，以單次給予模型組西藥氯胺酮（氯胺酮組）設為陽性參照組。結果

產后3周，與空白對照組比較，在蔗糖消耗測試中，模型組母鼠的糖水消耗百分比明顯降低（P＜0.01）；在強迫游泳測試中，模型組母鼠絕望狀態不動時間明顯延長（P＜0.01）；在陌生環境攝食實驗中，模型組母鼠攝食潛伏時間明顯增加而單位時間攝食量明顯減少（P＜0.01，P＜0.01）。而單次給予中藥越甘24 h之后，PPD模型母鼠的糖水消耗百分比明顯增加（P＜0.01），在強迫游泳測試中的絕望不動時間明顯降低（P＜0.01），陌生環境攝食測試中的潛伏時間明顯縮短，單位時間攝食量明顯增加（P＜0.01，P＜0.01），表現出與西藥氯胺酮相似的結果。結論 慢性孕前應激可誘導Balb／c母鼠表現出產后抑郁樣癥狀；中藥越甘對產后抑郁小鼠模型具有與西藥氯胺酮相似的快速抗抑郁作用。

關鍵詞：產后抑郁；孕前應激；小鼠模型；越鞠甘麥大棗湯；快速抗抑郁；氯胺酮

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．028．html

產后抑郁（postpartum depression，PPD）是以緊張、疑慮、內疚、恐懼，甚至絕望、離家出走，抑或出現傷嬰及自殺想法與行為為特征的精神疾患。PPD作為產后精神疾患的重要類型之一，隸屬于中醫腦病學的情志病范疇，其病因病機比較復雜［1］。臨床上西醫治療產后抑郁癥與治療抑郁癥采取的方法基本一致，而現有的西醫抗抑郁藥多存在起效緩慢［2］、價格昂貴、副作用明顯、影響哺乳等諸多問題，大多數患者和家屬無法接受。故尋求更為有效的快速安全的治療產后抑郁的方藥成為亟待解決的重要課題。

古往今來，臨床諸多醫家選用丹溪“統治六郁”的方藥越鞠丸化裁，或《金匱要略》的甘麥大棗湯化裁，以及將越鞠丸與甘麥大棗湯兩方合用（越甘）治療產后抑郁癥［3］，療效明顯。

目前，PPD基礎研究大多采用卵巢切除術后給予雌孕激素補充撤退法以模擬一種妊娠狀態，這與PPD的發病原因及臨床表現有一定差異。目前缺乏一個相對完善的更為貼近PPD臨床表現的動物模型。故本實驗選擇6～8周Balb／c母鼠為研究對象，孕前給予慢性應激，自然分娩后建立穩定可靠的產后抑郁癥動物模型，以一系列抑郁行為學測試對其進行評估。并以越甘干預該模型，以具有快速抗抑郁作用的氯胺酮作為對照，觀察越甘對產后抑郁模型小鼠的快速抗抑郁作用，旨在探索構建更為完善的產后抑郁動物模型，以及挖掘中醫藥中快速治療產后抑郁的經典方藥。

1　材料

1．1實驗動物 清潔級健康成年♀Balb／c小鼠32只，體質量18～24 g，軍事醫學科學院提供，動物合格證號：2007000581303。適應性飼養1周后用于實驗。動物房室溫25℃，濕度45%，明暗交替時間為12 h，動物可自由飲食進水。

1．2實驗藥物 實驗用中藥材購于南京中醫藥大學國醫堂門診，經本校藥學院專家鑒定，為中國藥典收載品種。越鞠甘麥大棗湯由蒼術100 g、香附100 g、神曲100 g、梔子100 g、川芎100 g、炙甘草125 g、淮小麥250 g、大棗375 g組成，上述藥物加8倍量水浸泡30 min，沸后煎煮1 h過濾，再加6倍量水，按上法煎煮后過濾，合并2次藥液，65℃減壓旋蒸濃

縮，濃縮后的藥物終濃度為8.3 g·kg－1。配好的藥物分裝在10 mL離心管內，－20℃保存。鹽酸氯胺酮（ketamine，Ket）注射液為福建古田制藥廠生產（批號：20140301）。臨用前用生理鹽水配成30 g· L－1的藥液。

1．3主要儀器 塑料小鼠籠（30 cm×60 cm×30 cm），強迫游泳視頻分析系統（上海吉量軟件公司），玻璃燒杯（直徑18 cm×高25 cm），旋轉蒸發儀（河南鞏義予華儀器設備有限公司），攝像機（Panason-ic），自制束縛管，蔗糖（國藥集團化學試劑有限公司），1 mL注射器（BD公司）。

2　方法

2．1動物分組及模型的制備

2．1．1動物分組 小鼠隨機分為2組，空白對照組（n＝8）和孕前應激模型組（n＝24），空白對照組不予任何應激，孕前應激組小鼠給予每天6 h的束縛應激刺激（am 11∶00－17∶00）。3周后將孕前應激組以1♀1♂分籠交配飼養。大約4周后，母鼠分娩，被定義為模型組。檢測行為學指標以判斷造模是否成功。

2．1．2模型的制備 將孕前應激模型組母鼠隨機分為3組模型組（n＝8），中藥越甘組（n＝8），西藥氯胺酮組（n＝8）。在產后21 d，越甘組以中藥越甘湯劑0.01 mL·g－1灌胃（相當于每g小鼠給予越甘生藥0.083 g）；氯胺酮組以西藥氯胺酮注射液0.01 mL· g－1腹腔注射（相當于每g小鼠給予氯胺酮0.03 mg）。24 h后，檢測母鼠的一系列行為學表現。

2．2小鼠的行為學測試指標

2．2．1蔗糖消耗測試（sucrose preference test，SPT）根據Dulawa的方法［4］加以改進，在孕前應激之前，對應激組和空白對照組給予兩瓶2%蔗糖溶液適應3 d。18 h禁水禁食以后，小鼠單籠飼養，每籠給予一瓶2%蔗糖溶液和一瓶自來水，觀察2 h蔗糖消耗量。蔗糖消耗百分比計算公式為：

蔗糖消耗／%＝［（蔗糖攝入量）／（蔗糖攝入量＋水的攝入量）］×100%

2．2．2強迫游泳實驗（forced swim test，FST） 采用Porsolt等［5］報道的方法，將小鼠分別放入玻璃燒杯中，水溫保持在24℃～26℃。讓小鼠在其中游泳2 min后，立刻開始觀察記錄接下來4 min內小鼠總的不動時間：即小鼠在水中停止掙扎，或呈漂浮狀態，僅有細小的肢體運動。

2．2．3陌生環境攝食實驗（novelty suppressed feed-ing test，NSFT） 小鼠禁食24 h后，被放置在一個新的鼠籠內，底部鋪上厚約1 cm的墊料，中心放置已經稱重的糧食。放入后，檢測小鼠開始吃食的潛伏時間。吃食的判斷標準是小鼠開始咀嚼食物，而不僅僅嗅食或者擺弄食物。以吃食的潛伏期和消耗食物的重量為觀測指標。如果小鼠5 min內沒有吃食則定義為潛伏時間是5 min。實驗中注意每次從同一位置、同一方向放入小鼠。單位時間攝食量計算公式為：

單位時間攝食量（g）＝5 min內消耗糧食重量（g）／小鼠體質量（g）

3　結果

3．1PPD模型組母鼠蔗糖消耗的表現及越甘對其蔗糖消耗的影響 結果顯示，模型組（Veh）母鼠蔗糖消耗百分比較空白對照組（Con）明顯降低（P＜0.01）；中藥越甘組（YG）和西藥氯胺酮組（Ket）母鼠的蔗糖消耗百分比較模型組均明顯增高（P＜0.01），越甘組與氯胺酮組無顯著性差異（Fig 1）。

Fig Percentage of sucrose preference in mice

3．2PPD模型組母鼠強迫游泳的表現及越甘對其強迫游泳不動時間的影響 模型組母鼠絕望不動持續時間明顯增加，與空白對照組相比差異有統計學意義（P＜0.01）；中藥越甘組和西藥氯胺酮組母鼠的不動時間較模型組均明顯降低（P＜0.01），越甘組與氯胺酮組差異無顯著性（Fig 2）。

3．3PPD模型組母鼠陌生環境攝食的表現及越甘對其行為學的影響 與空白對照組相比，模型組母鼠在陌生環境中攝食的潛伏期明顯延長（P＜0.01，Fig 3A），單位時間攝食量明顯減少（P＜0.01，Fig 3B）；給予中藥越甘及西藥氯胺酮干預后，均能明顯縮短攝食潛伏期（P＜0.01），增加單位時間攝食量（P＜0.01）。

越甘組與氯胺酮組差異無顯著性。

Fig 2 Immobility time of mice in forced swimming test

Fig 3 Latency and food consumption of mice in novelty supprested feeding test

4　討論

PPD是產褥期精神綜合征中最常見的一種類型，近年來發病呈逐年上升趨勢，嚴重影響產婦的身心健康及家庭與社會的和諧穩定，目前已成為比較突出的社會問題，引起國內外臨床醫生及科研工作者的關注。但在目前的PPD基礎研究中，動物模型存在著較多問題，迄今為止尚缺乏一個相對完善的的PPD模型。不管是Galea等［6］的卵巢去勢手術后外源性雌孕激素補充再撤退的造模方法，還是孕期給予皮質酮法、孕后行母嬰分離法［7］等等，其模型與臨床PPD在發病原因、行為表現等方面均存在一定差距。在此類模型上研究篩選抗抑郁藥物的意義不免會受到影響。

目前研究認為，PPD的發生與遺傳、心理因素和環境因素都有關，而其中最重要的環境因素是應激性事件。研究發現產婦在孕前經歷過應激性生活事件、既往罹患抑郁癥或經歷過抑郁狀態后發作PPD的幾率非常高［8］。持續的應激能明顯增加易感性個體發生情感障礙的可能性，這可能與應激導致海馬神經元損傷和神經元再生障礙，從而導致海馬等腦區神經元數量減少有關。

本研究首次采用慢性孕前束縛應激21 d對適齡♀小鼠造模，通過對產后3周母鼠的蔗糖消耗試驗、強迫游泳測試及陌生環境攝食測試評估該PPD模型。蔗糖消耗量降低被認為是抑郁癥快感缺乏的一個重要標準［9］。本研究中，模型組母鼠在產后3周出現糖水消耗百分比明顯下降，表明該模型母鼠表現出了抑郁癥的核心癥狀。在無法逃避的應激條件下，嚙齒類動物在強迫游泳測試中的不動狀態反映了其行為絕望，可以用于模擬人類的抑郁狀態。該研究中，模型母鼠在強迫游泳測試中絕望不動時間明顯增加。在陌生環境攝食測試中，模型母鼠的潛伏期明顯延長且單位攝食量減少，表明該產后抑郁模型母鼠伴有焦慮樣表型。上述一系列行為學表現均說明孕前應激誘導的PPD模型小鼠出現了快感缺失、興趣下降、行為絕望以及伴有焦慮現象，這與PPD患者的臨床癥狀極為相似，因此模型的建立是成功的。

目前臨床上西醫治療產后抑郁癥并無特異性藥物，而傳統的抑郁藥物如5-羥色胺重攝取抑制劑（selective serotonin reuptake inhibitor，SSRI）類大多需要連續服藥2～4周方能起效，加之對哺乳期婦女存在影響哺乳的問題，故抗抑郁快速起效的必要性毋庸置疑。抗抑郁藥物快速起效不僅可以迅速減輕患者痛苦，而且也快速減少患者的功能損害，降低產婦自殺或傷嬰的危險性，減輕抑郁癥帶來的社會經濟負擔減輕。

氯胺酮被公認為是具有快速持久抗抑郁作用的

一種藥物。它是腦內主要的興奮性神經遞質谷氨酸的一種受體（N-methyl-D-aspartate receptor，NMDAR）的拮抗劑。研究發現在臨床及動物實驗上，單次低劑量的氯胺酮具有快速持久的抗抑郁的效應［10］。還有研究發現采用小劑量氯胺酮預注剖宮產術產婦，發現其可明顯地降低產后3 d的愛丁堡產后抑郁量表分值及產后抑郁癥的發生率，認為小劑量氯胺酮預注對預防產后抑郁癥的發生具有一定的臨床意義。但是，氯胺酮具有神經毒性和成癮性等副作用，限制了其臨床使用。目前有許多學者以氯胺酮為參照，尋找具有與其相似的快速抗抑郁作用而沒有其副作用的理想藥物。

由于PPD發病原因及其機制的多樣性，當前以中藥復方治療PPD已經得到了國際上很多學者的認同，并且得到了廣泛的應用。越鞠丸和甘麥大棗湯是中醫調治情志異常的經典名方。越鞠丸出自《丹溪心法．六郁五十二》，方由蒼術、川芎、香附、神曲、山桅組成，功效行氣解郁。朱氏指出：“氣血沖和，萬病不生，一有怫郁，諸病生焉”，“越鞠丸，解諸郁”。我們課題組在前期研究中發現越鞠丸在ICR小鼠和昆明小鼠上具有與氯胺酮一致的快速緩解抑郁癥狀的功效［11］。甘麥大棗湯見于張仲景《金匱要略．婦人雜病脈證并治》，原文記載“婦人臟躁，喜悲傷欲哭，象如神靈所作，數欠伸，甘麥大棗湯主之。”方以甘草潤燥緩急，小麥養心安神，大棗補中益氣，甘潤滋補養心益脾安神。兩方相合，恰合PPD“多虛多瘀”的病機，病證結合，謹守病因。臨床上醫師以甘麥大棗湯合越鞠丸治療產后抑郁癥療效甚好。

該研究中，單次給藥24 h后，中藥越甘組可以明顯增加孕前應激PPD模型母鼠的糖水消耗百分比，降低模型母鼠在強迫游泳測試中的絕望不動時間，縮短模型母鼠陌生環境攝食測試中的潛伏時間，增加其單位時間內攝食量，與模型組相比差異均有統計學意義。本研究提示，在孕前應激誘導的PPD小鼠模型上，中藥越甘具有跟西藥氯胺酮一致的快速抗抑郁作用。

總之，孕前應激誘導的PPD小鼠模型無論在發病原因、行為表現還是藥物治療效果方面，均能較好地模仿出女性產后抑郁癥的發病及其外在癥狀、疾病轉歸以及藥物干預的一般狀況，基本達到廣泛認可的評判抑郁癥動物模型的標準（效度）［12－13］：結構效度、表面效度、預期效度。基于以上的比對結果，我們認為本研究所構建的PPD小鼠模型是一種較為完善的具有實驗研究價值的產后抑郁癥動物模型，而中藥越鞠甘麥大棗湯對產后抑郁小鼠模型具有快速起效的抗抑郁作用。下一步我們準備對越鞠甘麥大棗湯快速抗抑郁的機制進行深入的探索研究。

（致謝：本文實驗在南京中醫藥大學基礎醫學院中醫腦病校重點實驗室完成，特此致謝。）

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◇研究簡報◇

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Postpartum depression animal model in mice and effect of Yuejuganmaidazaotang on PPD model

XIA Bao-mei1，ZHANG Hai-lou1，XUE Wen-da1，CHEN Chang2，TAO Wei-wei1，WU Hao-xin1，CHEN Gang1
（1．Key Laboratory of Integrative Biomedicine of Brain Diseases，School of Basic Biomedical Science，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China；2．the First Clinical Medical College，Nanjing University of Chinese Medicine，Nanjing 210046，China）

Abstract：Aim To establish a postpartum depression animal model，assess the abnormal maternal behaviors of depressive dams，and observe the rapid antidepres-sant effects of the Yuejuganmaidazaotang（YG）on the PPD model．Methods Thirty-two female Balb／c were randomly assigned to two groups，the control group （Control，con）and the pre-pregnancy stressed group （Vehicle，veh），and vehicle was subjected to 3 weeks chronic restraint stress．After the last stressor，the pre-pregnancy stressed group was housed with a male．Af-ter about 4 weeks later，the mice gave birth to pups．Then at 3 weeks postpartum，we tested the maternal depressive-like behaviors，including sucrose preference test，forced swimming test and novelty suppressed feeding test．Both YG and Ketamine were single ad-ministered 24 hours before behavior test，with single saline for control group and PPD model group．Results After 3 weeks postpartum，the vehicle mice showed depression-like behaviors．Reduced preference in drinking sucrose solution was found in SPT（P＜0.01）．Immobility in FST was significantly increased in vehicle groups（P＜0.01）．In NSFT，the vehicle group displayed a significantly increased latency and reduced unit of food intake compared with control group（P＜0.01，P＜0.01）．Acute YG improved per-formance in the SPT（P＜0.01），FST（P＜0.01）and NSF（P＜0.01，P＜0.01），which was similar to ket-amine．Conclusions Chronic pre-pregnancy stress can induce dams into postpartum depression.Acute YG exert fast antidepressant effect on this PPD model simi-lar to ketamine．

Key words：postpartum depression；pre-pregnancy stress；mice model；yuejuganmaidazaotang；rapid anti-depressant effect；ketamine

作者簡介：夏寶妹（1982－），女，博士生，醫師，研究方向：抑郁癥的中醫藥研究，E-mail：babaysummer＠163．com；陳 剛（1972－），男，博士，特聘教授，博士生導師，研究方向：抑郁癥的中醫藥機制研究，通訊作者，Tel：025-85811160，E-mail：chengang＠njutcm．edu．cn

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81403041）；江蘇省高校優勢學科支持項目（PAPD）

收稿日期：2015－05－20，修回日期：2015－06－26

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1324－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．028