孕馬尿提取物中4種化學成分的雌激素活性研究

毛旭文，張 莉，杜冠華，高曉黎

（1．新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011，2．中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心，北京 100050）

孕馬尿提取物中4種化學成分的雌激素活性研究

毛旭文1，張 莉2，杜冠華2，高曉黎1

（1．新疆醫科大學藥學院，新疆烏魯木齊 830011，2．中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心，北京 100050）

中國圖書分類號：R-332；R329.24；R347.913；R392.11

摘要：目的 研究孕馬尿提取物中4種化學成分的雌激素活性。方法 研究4種成分3β-羥基-5α-16-孕甾烷-20-酮（3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one，HP）、5β-孕甾烷-3β，16α，20α-醇（5β-pregnane-3β，16α，20α-triol，PT）、3β，16α-脫氫-5α-孕甾烷-20-酮（3β，16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one，DHP）、3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮（3β-hydroxy-5α-androstan-17-one，HA）對人乳腺癌細胞MCF-7的細胞增殖效應（E-screen實驗）；利用Luciferase報告基因與雌激素反應元件重組，與轉染對照質粒pRL-cmv、雌激素受體ERα或ERβ質粒共同瞬時轉染中國倉鼠卵巢細胞CHO，構建雌激素活性篩選模型，檢測四種成分的雌激素活性。結果 E-screen實驗結果顯示，HP、PT、DHP、HA在1～50 μmol·L－1內均能誘導MCF-7細胞增殖，顯示出雌激素活性。與雌二醇（17α-estro-diol，E2）的增殖效應（proliferative effect，PE）、相對增殖效應（relative proliferative effect，RPE）和EC50相比，HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均小于E2的雌激素活性。Luciferase報告基因實驗結果顯示，HP、PT、DHP、HA在1～50 μmol·L－1內均能誘導Luciferase表達，顯示雌激素活性。與E2的EC50值相比，HP、PT、DHP、HA的雌激素活性均弱于E2的雌激素活性。結論 HP、PT、DHP、HA均具有雌激素活性，與E2的雌激素活性相比，四種化合物均發揮弱雌激素效應。

關鍵詞：雌激素活性；MCF-7；E-screen；報告基因；雌激素受體α；雌激素受體β

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．024．html

孕馬尿提取物（pregnant mare′s urine extract，PMUE）主要是一些雌激素的混合物，臨床上主要用于緩解因雌激素不足引起的女性更年期綜合征［1］，預防和治療骨質疏松癥［2］、冠心病［3］以及老年癡呆癥［4］。孕馬尿中至少含有200種以上的化學成分［5］，本課題組確定了PMUE中除主成分以外的4種成分，分別為：3β-羥基-5α-16-孕甾烷-20-酮（3β-hydroxy-5α-pregn-16-en-20-one，HP）、5β-孕甾烷-3β，16α，20α-醇（5β-pregnane-3β，16α，20α-triol，PT）、3β，16α-脫氫-5α-孕甾烷-20-酮（3β，16α-dihydroxy-5α-pregnan-20-one，DHP）、3β-羥基-5α-雄甾烷-17-酮（3β-hydroxy-5α-androstan-17-one，HA），見Fig 1。本實驗利用兩種體外方法評價4種成分的雌激素活性，首先考察4種成分對人乳腺癌細胞MCF-7的增殖作用（Escreen實驗），其次利用雌激素反應元件與熒光素酶報告基因的重組質粒（pGM-ERE-Lucif-erase）及雌激素受體（ERα或ERβ）質粒瞬時共轉染中國倉鼠卵巢細胞CHO，建立雌激素活性篩選系統，探討四種成分的雌激素活性。

Fig 1 Structures of four kinds of chemical composition

1　材料與方法

1．1材料 人乳腺癌細胞株MCF-7、中國倉鼠卵巢細胞株CHO由中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心贈送。pCMV-ERα和pCMV-ERβ質粒購買于北京義翹神州生物有限公司；pGM-ERE-Luc質粒購買于上海吉滿生物有限公司；pRL-CMV質粒購買于美國Promega公司。17β-雌二醇購買于中國食品藥品檢定研究院；HP、PT、DHP、HA均購買于Sigma-Aldrich公司，貨號分別為：198886、196347、

362379、198110；孕馬尿提取物為本實驗室自制。RPMI 1640、DMEM無酚紅培養基（石家莊宏偉生物技術有限公司）；胰蛋白酶（吉諾生物技術有限公司）；活性炭／葡聚糖法去除激素的胎牛血清（char-coal dextran treated FBS，CD-FBS）為自制；DMSO（北京百順化學科技有限公司）；MTT購買于Sigma-Aldrich公司；全波長多功能酶標儀（Perkin Elmer，美國）；雙熒光素檢測系統試劑盒（碧云天生物有限公司）；感受態大腸桿菌（TaKaRa公司）；質粒提取試劑盒（Omega公司）；Fugen-6轉染試劑購買于美國Promega公司等。

1．2實驗分組 （1）溶劑對照組；（2）陽性對照組：E2（10－5、10－4、10－3、10－2、10－1μmol·L－1）；（3）實驗藥物組：HP、PT、DHP、HA均為1、5、10、20、30、40、50 μmol·L－1；PMUE（10－5、10－4、10－3、10－2、10－1mg·L－1）。

1．3細胞培養 MCF-7細胞培養在含10%CD-FBS的無酚紅RPMI 1640的培養體系中，CHO細胞培養在含10%CD-FBS的無酚紅DEME的培養體系中，培養體系中加入100 IU·L－1青霉素和100 mg·L－1鏈霉素，置于37℃、5%CO2飽和濕度孵育箱中培養，每2天更換1次培養基，培養至細胞處于對數生長期時進行實驗。

1．4MCF-7細胞增殖實驗（E-screen Assay） 取對數生長期的MCF-7細胞，以4×107個·L－1濃度接種于96孔板，每孔90 μL。37℃孵育24 h后，給予不同濃度的待測物，每孔10 μL，繼續孵育6 d。6 d后，用MTT法檢測細胞增殖率。E-screen實驗用增殖效應（proliferative effect，PE）和相對增殖效應（relative proliferative effect，RPE）評價待測物的雌激素活性的強度。

1．5Luciferase報告基因實驗 取對數生長期的CHO細胞，以1×108·L－1濃度接種于24孔板，每孔1 mL。轉染前4 h，用PBS漂洗細胞2次，加入不含CD-FBS的無酚紅DMEM培養基。將5 μL pGM-ERE-Luc、5 μL pRL-CMV、5 μL pCMV-ERα或pC-MV-ERβ質粒與轉染試劑混合，室溫靜置15 min，將混合物加入到CHO細胞培養基中，置于37℃、5% CO2培養箱中培養24 h。轉染24 h后，取出24孔板棄去培養基，PBS漂洗細胞2次，加入含10%CD-FBS的無酚紅DMEM培養基，分別給予不同濃度待測物，繼續培養48 h。48 h后，棄去培養液，按照雙熒光素檢測系統試劑盒的操作說明，用全波長多功能酶標儀測定化學發光值。Luciferase報告基因實驗的評價指標為相對雌激素活性（relative estrogenic activity，REA），REA是Luciferase化學發光值與pRL-CMV的化學發光值的比值。

1．6比較E-screen實驗與Luciferase報告基因實驗 以estradiol equivalent quantity（EEQ）為評價指標比較兩種實驗檢測雌激素活性的一致性與差異性。

EEQ／%＝EC50（E2）／EC50（sample）×100%

2　結果

2．1E-screen實驗評價雌激素活性 與空白溶劑對照組比較，HP、PT、DHP、HA和PMUE在受試濃度下均可以明顯誘導MCF-7細胞增殖（P＜0.01），并呈現出劑量依賴性，結果顯示，HP、PT、DHP、HA和PMUE均具有雌激素的活性。見Tab 1，Fig 2。

Tab 1 PE%，RPE%and EC50values of four test compounds according to the E-screen assay（±s，n＝3）

Tab 1 PE%，RPE%and EC50values of four test compounds according to the E-screen assay（±s，n＝3）

**P＜0.01 vs E2group．

Compound　PE　RPE／%　EC50／μmol·L－1E2　6．58±0．23　100　（5．68±0．22）×10－5HP　3．88±0．05　51．73±3．14　3．67±0．04**PT　3．69±0．06　48．39±2．21　3．69±0．03**DHP　3．75±0．03　49．37±2．22　3．34±0．10**HA　2．27±0．04　22．71±1．31　4．98±0．07**PMUE　6．53±0．15　99．38±5．23（8．56±0．93）×10－5mg·L－1

2．2Luciferase報告基因實驗評價雌激素活性與空白溶劑對照組相比，HP、PT、DHP、HA和PMUE均能誘導由ERα或ERβ介導的熒光素酶表達（P＜0.01或P＜0.05），并呈現出劑量依賴性，顯示出雌激素活性。見Fig 3～6，Tab 2。

2．3比較E-screen實驗與Luciferase報告基因檢測實驗 兩種實驗均檢測到HP、PT、DHP、HA具有雌激素的活性，對比兩種實驗的EEQ沒有明顯的差異（P＞0.05），說明E-screen實驗與Luciferase報告基因實驗結果差異無顯著性。E-screen實驗中EEQ均稍微高于Luciferase報告基因實驗的Mean EEQ，可能由于二者的作用對象與作用時間不同，導致兩種實驗的檢測靈敏度不同。E-screen實驗的作用對象是細胞，作用時間為144 h，而Luciferase報告基因實驗

的作用對象是受體，作用時間為48 h。見Tab 3。

Tab 2 EC50values of four analytes according to the Luciferease report gene assay（±s，n＝3）

Tab 2 EC50values of four analytes according to the Luciferease report gene assay（±s，n＝3）

**P＜0.01 vs E2group．

Compound ERα EC50／μmol·L－1ERβ EC50／μmol·L－1E2　　（2．47±0．12）×10－5　　（4．74±0．05）×10－5HP　3．16±0．04　2．48±0．14**PT　2．59±0．06　2．44±0．09**DHP　2．67±0．11　2．92±0．11**HA　5．85±0．12　6．29±0．15**PMUE　（7．16±0．67）×10－5mg·L－1（5．93±0．42）×10－5mg·L－1

3　討論

Tab 3 Estrogenic activities of four test samples in MCF-7 cells（E-screen assay）and in Luciferease report gene cells（Luciferease report gene assay）（±s，n＝3）

Tab 3 Estrogenic activities of four test samples in MCF-7 cells（E-screen assay）and in Luciferease report gene cells（Luciferease report gene assay）（±s，n＝3）

Compound　E-screen assay EEQ／% Luciferease report gene assay ERα EEQ／%　ERβEEQ／%Mean EEQ／% HP　（1．6±0．41）×10－3　　（0．8±0．06）×10－3　　（1．7±0．38）×10－3　　（1．2±0．22）×10－3PT　（1．6±0．73）×10－3　　（1．0±0．18）×10－3　　（1．9±0．56）×10－3　　（1．4±0．35）×10－3DHP　（1．8±0．38）×10－3　　（0．9±0．05）×10－3　　（1．6±0．35）×10－3　　（1．3±0．20）×10－3HA　（1．2±0．34）×10－3　　（0．4±0．03）×10－3　　（0．8±0．01）×10－3　　（0．6±0．02）×10－3PMUE　16．69±0．75　9．39±0．26　21．77±0．69　15．58±0．47

Fig 2 Proliferative effects induced by test samples in MCF-7 cells（E-screen test）（±s，n＝3）

E-screen實驗是由Soto等［6］最早提出，采用MCF-7細胞增殖實驗評價化合物的雌激素活性，稱為雌激素篩檢（E-screen）實驗，是一種常用的體外檢測外源雌激素的方法。E-screen實驗檢測化合物的雌激素活性，酚紅對MCF-7細胞有誘導細胞增殖作用，同時血清中的內源性雌激素對MCF-7細胞也有明顯的誘導細胞增殖作用。采用活性炭／葡聚糖處理的FBS與無酚紅RPMI 1640培養基培養MCF-7細胞，避免酚紅和內源性雌激素對E-screen實驗干擾。四種化合物與MCF-7細胞作用后，與空白溶劑對照組比較，HP、PT、DHP、HA均可以明顯誘導MCF-7細胞增殖（P＜0.01），增殖效應與受試濃度呈現出劑量依賴性，HP、PT、DHP、HA均在20 μmol·L－1誘導MCF-7達到最大增殖效應。與E2的EC50相比，HP、PT、DHP、HA的EC50相差105倍（P＜0.01），HP、PT、DHP、HA的PE也遠小于E2的PE值（P＜0.01），HP、PT、DHP、HA的RPE小于100%，說明四種物質顯示出的雌激素效應小于E2的雌激素效應。PMUE 的EC50與E2的EC50相比沒有差異（P＞0.05），其PE值與E2的PE沒有差異（P＞0.05），PMUE的RPE接近100%，說明PMUE的雌激素效應與E2的雌激素效應相同。HP、PT、DHP、HA的EC50與PMUE的EC50相

差105倍，其PE值均小于PMUE的PE值（P＜0.01），其RPE值均小于PMUE的RPE值（P＜0.01），說明PMUE顯示出雌激素效應強于HP、PT、DHP、HA的雌激素效應，這是因為PMUE中含有雌二醇、雌酮、馬烯雌酮等多種雌激素，且這些成分都是PMUE的主要成分。根據RPE值判斷四種化合物發揮雌激素的活性由強到弱順序為：HP＞DHP＞PT＞HA。

Fig 3 ERα-mediated ERE-driven transcriptional activation in CHO cells（±s，n＝3）

Fig 4 Transcriptional efficiency of ERα，ERE-Luciferase（±s，n＝3）

本實驗將雌激素反應元件pGM-ERE-Luc、轉染對照質粒pRL-CMV、雌激素受體pCMV-ERα或pC-MV-ERβ質粒瞬時共轉染CHO細胞建立雌激素受體細胞篩選系統，利用此系統檢測HP、DHP、PT、HA是否與ERα或ERβ結合并發揮雌激素活性。結果顯示，在10－5～10－2μmol·L－1的范圍內，隨著E2濃度增大，熒光素酶的表達值升高，濃度增大到10－2μmol ·L－1，熒光素酶的表達值最高，當E2增大到10－1μmol·L－1時，熒光素酶的表達值下降。HP、PT、DHP、HA在1～20 μmol·L－1的濃度范圍內，隨著濃度的增加，熒光素酶的表達值升高，但是，當濃度增大到20 μmol·L－1時，熒光素酶的表達值最高，當濃度增大到30 μmol·L－1時，熒光素酶的表達值反而減小。以上現象可能由于雌激素受體達到飽和，待測物樣品濃度繼續增加，熒光素酶的表達值反而減小。E2與ERα結合的REA值比與ERβ結合的REA值

高4倍左右，說明E2與ERα結合的親和力高于與ERβ結合的親和力。通過比較REA值，HP、PT、DHP、HA、PMUE與ERβ結合后的REA與ERα結合后的REA無差異（P＞0.05），說明HP、PT、DHP、HA 與ERβ結合的親和力與ERα結合的親和力相同。與E2的EC50相比，HP、PT、DHP、HA的EC50與雌二醇相差105倍（P＜0.01），說明4種物質顯示出的雌激素效應比雌二醇的雌激素效應弱。PMUE的EC50與E2相比差異無顯著性（P＞0.05），說明PMUE顯示出的雌激素效應與E2的雌激素效應相同。HP、PT、DHP、HA的EC50與PMUE的EC50相差105倍，說明PMUE顯示出雌激素效應強于HP、PT、DHP、HA的雌激素效應，因為PMUE中含有多種活性較強的雌激素。

Fig 5 ERβ-mediated ERE-driven transcriptional activation in CHO cells（±s，n＝3）

Fig 6 Transcriptional efficiency of ERβ，ERE-Luciferase（±s，n＝3）

根據文獻報道［6－10］，E2在10－5～10－1μmol· L－1范圍內顯示雌激素效應，本實驗在此濃度范圍內考察了HP、PT、DHP、HA及PMUE的雌激素活性，發現在10－5～10－1μmol·L－1內，HP、PT、DHP、HA并未顯示雌激素活性，而PMUE在10－5～10－1μmol· L－1范圍內顯示雌激素效應。增大濃度至1～50 μmol ·L－1，發現HP、PT、DHP、HA可以誘導luciferase表達，顯示雌激素效應并呈劑量依賴性，因此實驗組的劑量設置在1～50 μmol·L－1。

本實驗利用兩種體外檢測方法：E-screen實驗和luciferase報告基因實驗評價HP、PT、DHP、HA的雌

激素活性，兩種方法均能檢測出HP、PT、DHP、HA具有雌激素活性，但是與E2的雌激素活性相比，HP、PT、DHP、HA均發揮弱雌激素活性。有機體是一個復雜的體系，體外實驗結果最終需要與動物實驗相結合，在未來的研究中，本課題組還要通過動物實驗來考察HP、PT、DHP、HA的雌激素活性，才能使結果更加準確、可靠。

（致謝：本文實驗是由新疆醫科大學與中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心合作提供實驗條件，本人對中國醫學科學院藥物研究所國家藥物篩選中心的全體研究人員表示衷心的感謝。）

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Estrogenic activities of four components from pregnant mare’s urine extract

MAO Xu-wen1，ZHANG Li2，DU Guan-hua2，GAO Xiao-li1
（1．Dept of Pharmacy，Xinjiang Medical University，Urimuqi 830011，China；2．Beijing Key Laboratory of Drug Target Identification and Drug Screening，Institute of Materia Medica，Chinese Academy of Medical Sciences＆Peking Union Medical College，Beijing 100050，China）

Abstract：Aim To investigate the estrogenic activities of four components from pregnant mare’s urine extract．Methods The estrogenic activities of four components were assessed using two in vitro tests：the MCF-7 cell proliferation assay（E-screen test）and the luciferase transfected CHO cell gene reporter assay．In the lucifer-ase reporter gene assay，the reporter gene plasmids PGM-ERE-Luc and ERα or ERβ and a control plasmid （pRL-cmv）were transiently co-transfected into CHO cells to establish an ERα-or ERβ-cell screening system which was used to measure estrogenic activity of four compounds．Results MCF-7 cells treated with HP，DHP，PT and HA significantly proliferated，thereby of-fering in vitro evidence for the estrogenic activities of HP，DHP，PT and HA，and they showed dose-depend-ent activities．Compared EC50of PE and RPE with that of E2，HP，DHP，PT and HA exerted relatively weak estrogenic activities．The in vitro ER-mediated reporter gene assay revealed that HP，DHP，PT and HA dis-played estrogenic activities mediated by ERβ or ERα．Compared with the EC50of E2，HP，DHP，PT and HA exhibited lower estrogenic potencies．Conclusion HP，DHP，PT and HA possess weaker estrogenic activities than E2．

Key words：estrogenic activities；MCF-7；E-screen Assay；reporter gene；estrogen receptor α；estrogen re-ceptor β

作者簡介：毛旭文（1986－），女，博士，研究方向：新疆地方資源藥物研發，E-mail：358178217＠qq．com；高曉黎（1962－），女，博士，教授，博士生導師，研究方向：新疆地方資源藥物研發，通訊作者，E-mail：xli＿g＠sina．com

基金項目：國家十二五“重大新藥創制”科技重大專項（No 2011ZXO9203）；新疆維吾爾自治區重大科技專項（No 201130101）

收稿日期：2015－05－23，修回日期：2015－06－25

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1304－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．024