白藜蘆醇對大鼠腦缺血／再灌注損傷后星形膠質細胞活化的影響

余萍萍，王 莉，唐凡人，周露玲，曾 立，宋曉松，陳吉祥，楊 琴

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016）

白藜蘆醇對大鼠腦缺血／再灌注損傷后星形膠質細胞活化的影響

余萍萍，王 莉，唐凡人，周露玲，曾 立，宋曉松，陳吉祥，楊 琴

（重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶 400016）

中國圖書分類號：R-332；R284.1；R322.81；R743.310.22；R743.310.531；R977.6

摘要：目的 研究白藜蘆醇對大鼠腦缺血／再灌注損傷后星形膠質細胞活化的影響。方法 45只SD♂大鼠隨機分成假手術組（Sham）、對照組（Con）和白藜蘆醇組（30 mg· kg－1，Res），每組15只。于缺血／再灌注后3 h使用白藜蘆醇或溶劑治療，連用7 d。腦缺血24 h時，TTC法檢測腦梗死體積，HE染色檢測病理變化，Longa評分行神經功能評分，免疫組織化學檢測缺血半暗帶皮質半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）的表達。腦缺血14 d時，免疫組織化學及免疫熒光法檢測膠質纖維酸性蛋白（glial fibrillary acidic pro-tein，GFAP）和神經元NeuN蛋白表達。結果 白藜蘆醇治療較對照組能明顯改善神經功能、減小梗死體積、減少神經元脫失及凋亡，抑制星形膠質細胞的活化與增殖（P＜0.01）。結論 白藜蘆醇治療可抑制星形膠質細胞的異常活化，保護缺血半暗帶神經元，改善神經功能。

關鍵詞：白藜蘆醇；腦缺血；再灌注損傷；星形膠質細胞；神經元；活化

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．010．html

缺血性腦血管病具有高發病率、高致殘率、高死亡率的特點，嚴重威脅患者健康甚至危及患者生命。腦缺血發生后，病理生理十分復雜，包括興奮性氨基酸毒性、氧化應激損傷、線粒體功能障礙、鈣超載、炎癥因子介導等［1－2］。近年研究顯示，星形膠質細胞異常活化也在腦缺血性損傷中扮演重要角色。其可影響神經元生存，導致神經元死亡，從而介導腦缺血后的繼發性神經損傷［3－4］。因此，采用各種有效手段抑制腦缺血后星形膠質細胞異常活化，對減輕腦缺血損傷后神經修復具有重要意義。

白藜蘆醇（resveratrol，Res）是一種含有芪類結構非黃酮類多酚化合物的植物抗毒素，存在于葡萄皮、花生及中藥虎杖、藜蘆、決明等72種植物中，具有抗腫瘤、抗炎、清除自由基、抗氧化、抗血小板聚集、抗動脈粥樣硬化、雌激素樣作用等多方面藥理活性［5－6］。攝入富含白藜蘆醇的飲食能明顯減少心腦血管疾病的發生。隨后在體內外實驗性腦卒中模型的研究中觀察到白藜蘆醇預處理具有神經保護作用。我們前期的研究也顯示，白藜蘆醇預處理能通過抗凋亡、抗氧化等作用改善腦缺血后大鼠神經功能、減小腦梗死體積，增強氧糖剝奪模型原代皮質神經元活力及神經干細胞增殖等［7－11］。在腦缺血之后，給予白藜蘆醇治療，其能否通過影響星形膠質細胞的活化，從而改善神經功能，目前尚不清楚。

因此，本實驗擬采用大鼠大腦中動脈栓塞缺血／再灌注模型（middle cerebral artery ischemia／reperfu-sion，MCA I／R），在缺血后3 h給予白藜蘆醇治療，觀察白藜蘆醇對神經功能、梗死體積、細胞凋亡及星形膠質細胞（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和神經元核抗原NeuN蛋白表達的影響，為白藜蘆醇的臨床前應用提供依據。

1　材料與方法

1．1實驗動物 SPF級♂3個月200～250 g SD大鼠，由重慶醫科大學動物實驗中心提供。動物合格證號：SCXK（渝）2012－0001。

1．2藥物與主要試劑 白藜蘆醇（純度度≥98%）購于陜西慈緣生物技術有限公司，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）購于索萊寶公司，多克隆兔抗Caspase-3、多克隆兔抗GFAP購于Abcam公司，單克隆鼠抗NeuN購于Millipore公司。免疫組化試劑盒PV-9001、熒光二抗（山羊抗鼠RFITC）和山羊血清封閉液購于北京中杉金橋生物技術有限公司，DAPI和抗熒光淬滅封片液購于碧云天生物技術公司，水合氯醛購自成都市科龍化工試劑公司。其他試劑均為國產分析純。

1．3大鼠大腦中動脈缺血／再灌注模型的建立 大鼠MCA I／R模型制備采用Longa等［12］的改良線栓法。選用進口魚線，直徑0.23～0.26 mm，長4.0

cm，頭端去棱角使其光滑，在距離頭端2.0 cm處做黑色標記，乙醇消毒后備用。大鼠術前禁食12 h，自由飲水，經腹腔注射10%水合氯醛0.3 ml／100 g麻醉后，仰臥位固定，消毒后頸部正中切口，分離右側頸總動脈，頸內外動脈，結扎頸總動脈近心端及頸外動脈遠心端，在頸內動脈近端備線，遠端放置動脈夾，頸總動脈分叉膨大處切口，松開動脈夾，向頸內動脈插入魚線18～20 mm（據體重而定），結扎頸總動脈并固定魚線，外留10 mm線頭，縫合皮膚。缺血60 min后，將線栓拉出至頸總動脈結扎端進行再灌注，術后用白熾燈加熱維持大鼠體溫，蘇醒后放回鼠籠，自由飲食。

1．4動物分組及給藥 將45只SD大鼠隨機分為假手術組（Sham）、對照組（Con）、白藜蘆醇組（Res），每組15只。白藜蘆醇組于MCA I／R后3 h經腹腔注射白藜蘆醇（30 mg·kg－1，無水乙醇稀釋），每天1次，連續7 d。假手術組，只分離右側頸總動脈及頸內外動脈，但不插線。對照組給予MCA I／R。假手術組與對照組每日經腹腔注射等容量的無水乙醇，每天1次，連續7 d。

1．5神經功能缺損評分 按照Longa等［12］評分標準：0分為正常，無神經學征象；1分為動物不能完全伸展左前肢；2分為動物左側肢體癱瘓，行走時向左側轉圈，出現追尾現象；3分為動物行走向左側跌倒，或動物不能站立或動物打滾；4分為無自發活動，有意識障礙。神經功能缺損評分在1～3分為模型成功，0分和4分均剔除，各組分別于術后24 h進行行為學評分。

1．6TTC法測定腦梗死體積 各實驗組隨機取4只大鼠，在術后24 h斷頭取腦，在－20℃冰箱速凍15 min，剔除嗅腦、低位腦干及小腦，冠狀位將其切成6等份切片，置于2%TTC溶液中，37℃避光孵育30 min，白色為梗死灶，紅色為正常腦組織，4%多聚甲醛液固定，數碼相機拍照。按顏色小心分離梗死組織及正常組織，分別固定、拍照、分離、稱重。腦梗死體積／%＝蒼白區重量／（蒼白區重量＋非蒼白區重量）×100%。

1．7HE染色檢測腦梗死區域病理形態的改變缺血24 h，每組選取1只大鼠，麻醉、灌注取腦后，放入4%多聚甲醛固定1 d，石蠟包埋切片，常規蘇木精－伊紅染色，光學顯微鏡下觀察缺血側皮質病理形態學改變。

1．8免疫組化技術檢測 缺血14 d，每組隨機取4只大鼠，經麻醉、開胸，主動脈插管，依次灌注生理鹽水250 mL和4%多聚甲醛200 mL，斷頭取腦，放入4%多聚甲醛固定1 d，常規石蠟包埋切片。按照免疫組織化學試劑盒說明書，采用石蠟切片微波修復抗原免疫組化PV二步法染色程序。4 μm厚石蠟切片于60℃烤箱烤片30 min；二甲苯Ⅰ、Ⅱ各10 min、乙醇梯度脫水各5 min；將切片浸入0.01 mol· L－1枸櫞酸鹽緩沖液，微波爐進行熱修復15 min，室溫冷卻后用0.1 mol·L－1PBS洗滌2 min×3次；3%H2O2去離子水孵育10 min，以阻斷內源性過氧化物酶；PBS洗滌，滴加稀釋的一抗Caspase-3（1∶100）、GFAP（1∶100），置于濕盒中，4℃冰箱過夜；PBS洗滌2 min×3次；滴加試劑1（polymer Help-er），37℃孵育20 min，PBS洗滌2 min×3次；滴加試劑2（poly-HRP anti-rabbit IgG），37℃孵育20 min，PBS洗滌2 min×3；應用DAB溶液顯色，自來水充分沖洗、復染、脫水、透明、中性樹膠封片。顯微鏡下觀察Caspase-3和GFAP的陽性細胞數，每組選取8張（每只大鼠選取2張）進行計數統計。

1．9免疫熒光技術檢測 缺血14 d，每組隨機取4只大鼠，經麻醉、開胸，主動脈插管，灌流取腦，4%多聚甲醛固定24 h，蔗糖梯度脫水沉底后，制成10 μm厚的腦組織冰凍切片，將切片晾干后，用丙酮室溫固定30 min，PBS洗3次；用0.2%Triton100破膜20 min，37℃孵育，PBS洗3次；山羊血清封閉2 h，去除多余血清，不洗；加一抗（NeuN 1∶100），4℃過夜；PBS洗3次，加熒光二抗（抗體工作濃度1∶100），37℃避光孵育1.5 h；PBS漂洗3次DAPI染核5 min；用PBS漂洗3次，用熒光淬滅劑封片，共聚焦下觀察照相。激光共聚焦下觀察NeuN的陽性細胞數，每組選取8張（每只大鼠選取2張）進行計數統計。

1．10統計學分析 應用SPSS 17.0統計軟件進行統計分析，實驗數據以±s表示。多組數據的比較采用單因素方差分析，兩組間數據的比較采用LSD檢驗。

2　結果

2．1動物的存活情況 在45只實驗大鼠中，對照組和白藜蘆醇組各有1只神經功能評分為4，被剔除。模型組有1只在MCA I／R 24 h時死亡，解剖可見顱底大量血凝塊，考慮血管破裂導致蛛網膜下腔出血。成活42只。

2．2白藜蘆醇對MCA I／R后24 h大鼠神經功能的影響 神經功能評分顯示，假手術組無神經功能缺損，對照組和白藜蘆醇組均出現了明顯的神經行為障礙，但白藜蘆醇組較對照組癥狀得到明顯改善，神經行為學評分明顯降低（P＜0.01，Fig 1）。

2．3白藜蘆醇對MCA I／R后24 h大鼠腦梗死體積的影響 TTC染色顯示假手術組無梗死灶，對照組和白藜蘆醇組缺血側腦組織有明顯的梗死灶，但白藜蘆醇組梗死灶體積較對照組明顯縮小（P＜0.01）（Fig 2）。

Fig 1 Effects of resveratrol on neurological function after 24h for MCAI／R in rats

Fig 2 Effects of resveratrol on the cerebral infarction volume after 24h for MCA I／R in rats

2．4白藜蘆醇對MCA I／R后24 h腦缺血大鼠皮質病理學和Caspase-3蛋白表達的影響 HE染色顯示，假手術組（Fig 3A）大鼠皮質神經元密集，細胞質豐富，細胞核居中染色清楚，形態正常，組織結構完整。在大鼠腦缺血24 h，對照組（Fig 3B）大鼠皮質神經元排列散亂，細胞間質疏松，細胞膜皺縮，細胞核固縮或碎裂；白藜蘆醇組（Fig 3C）神經細胞核固縮減輕，多數細胞核仁清晰，結構較完整。

在大鼠腦缺血24 h，免疫組化顯示對照組（Fig 3E）和白藜蘆醇組（Fig 3F）皮質Caspase-3陽性細胞數均明顯多于假手術組（Fig 3D，P＜0.01），但白藜蘆醇組較對照組Caspase-3陽性細胞數明顯減少（P ＜0.01，Fig 3E和F）。

2．5白藜蘆醇對MCA I／R后14 d腦缺血大鼠皮質GFAP和NeuN蛋白表達的影響 在大鼠腦缺血14 d，免疫組化顯示對照組（Fig 4 B）和白藜蘆醇組（Fig 4C）皮質GFAP陽性細胞數均明顯多于假手術組（Fig 4A），且細胞體積增大，突起增大、增多，GFAP陽性強度更強（P＜0.01），但白藜蘆醇組較對照組明顯減少（P＜0.01，Fig 4）。

免疫熒光顯示對照組（Fig 4E）和白藜蘆醇組（Fig 4F）皮質NeuN陽性細胞明顯少于假手術組（Fig 4 D，P＜0.01），但白藜蘆醇組NeuN表達較對照組明顯增加（P＜0.01，Fig 4）。

3　討論

白藜蘆醇是一天然的植物抗毒素。流行病學資料顯示，地中海地區飲食習慣能明顯減少心腦血管疾病的發生率，其原因是食物中含豐富的白藜蘆醇。隨后的研究也顯示白藜蘆醇預處理能減輕缺血性腦損害，這表明白藜蘆醇可用于腦血管疾病的預防。在腦缺血發生之后，白藜蘆醇有治療作用嗎？研究證實，在腦缺血后24 h內給予白藜蘆醇也能通過抗氧化、抗炎、抗凋亡等途徑保護腦組織，減小腦梗死體積，改善神經功能［13－14］。在本研究中，我們于大鼠腦缺血后3 h給予白藜蘆醇治療，結果顯示白藜蘆醇能明顯改善神經功能、減小腦梗死體積、減少神經元脫失。我們的研究結果結合以往的文獻均表明，白藜蘆醇對缺血性腦損害有治療作用。

缺血性腦損傷可導致神經組織和神經細胞嚴重受損，其病理變化包括神經元和膠質細胞的變化。以往關注的焦點是采取各種措施減輕腦缺血對神經元的損傷。近年來，星形膠質細胞對腦缺血后神經功能恢復積極或消極的影響，逐漸被神經科學研究者關注。星形膠質細胞占神經細胞的50%～60%，具有維持神經元的正常功能、神經細胞內外離子濃度、pH值平衡，調控腦血流量，調節體液平衡，參與新陳代謝及突觸可塑性，構成血腦屏障等多種生物學功能［15］。大量研究表明，星形膠質細胞不再局限于對腦保護及營養支持作用。其對缺血缺氧及酸中毒較敏感［16］。在腦缺血缺氧損傷早期，星形膠質細胞引起炎癥反應，促進谷氨酸、S-100β釋放，激活水通道蛋白4，上調血管內皮生長因子、基質金屬蛋白

酶的表達，釋放一氧化氮，從而導致腦水腫，損害神經元，對損傷后恢復造成不利影響；在腦缺血損傷晚期，星形膠質細胞可異常活化及形成膠質疤痕、以及釋放炎癥因子和神經毒性分子，從而加重神經元對損傷因素的易損性、敏感性和軸突再生障礙，阻止神經功能的恢復，最終引起神經細胞發生繼發性損傷［17］。因此，尋找有效的手段抑制星形膠質細胞過度活化及膠質疤痕形成，有利于改善腦缺血后的神經功能，具有重大的臨床意義。

Fig 3 Effects of resveratrol on pathological change（HE staining）and protein expression of caspase-3（immunohistochemistry）of cortex after 24h for MCA I／R in rats（×400）

Fig 4 Effects of resveratrol on protein expression of GFAP（immunohistochemistry）and NeuN（immunofluorescence，RFITC，DAPI）after 14d for MCA I／R in rats（×400）

GFAP是星形膠質細胞的特異性標志蛋白。NeuN是一種表達在成熟神經元的特異性蛋白，廣泛用于研究和鑒別成熟神經元。Catrinel等在大鼠全腦缺血10 min的腦缺血模型中，于7 d時觀察到海馬CA1區GFAP陽性細胞數明顯增多，細胞形態增大腫脹，突起增多增粗，而神經元數量減少約50%。給予白藜蘆醇預處理21 d再全腦缺血10 min，于7 d時海馬CA1區GFAP陽性細胞數明顯低于對照組，而神經元數量明顯多于對照組，表明腦缺血引起了星形膠質細胞的活化，損害了神經元，而白藜蘆醇預處理能抑制星形膠質細胞的活化，減少神經元的脫失［18］。我們在大鼠MCA I／R后14 d也觀察到模型組缺血半暗帶皮質區GFAP的表達明顯增強，GFAP陽性細胞數明顯增加，且細胞體積增大，突起多而粗；而NeuN陽性細胞數明顯減少。在MCA I／R后3 h給予白藜蘆醇治療，24 h時缺血半暗帶皮質區caspase-3陽性細胞數明顯低于對照組，14 d時缺血半暗帶皮質區GFAP的表達及GFAP陽性細胞數明顯低于對照組，且細胞體積較對照組小，突起沒有對照組多而粗；而NeuN陽性細胞數明顯較對照組多。也表明腦缺血損傷導致了細胞凋亡，星形膠質細胞的異常活化和增殖，破壞了神經元，而白藜蘆醇治療能減少細胞凋亡，抑制星形膠質細胞的活化

和增殖，減少神經元的脫失。文獻及我們的研究表明腦缺血前預防性或腦缺血后治療性使用白藜蘆醇均能減少細胞凋亡，抑制星形膠質細胞的活化和增殖，減少神經元的脫失。

我們的前期研究表明白藜蘆醇預處理有神經保護作用。目前我們在腦缺血后3 h給予白藜蘆醇治療也顯示能減少梗死體積，減少細胞凋亡，抑制星形膠質細胞的活化和增殖，減少神經元的脫失，從而促進神經功能恢復。這是對前期工作的延伸。白藜蘆醇抑制星形膠質細胞的活化和增殖的機制如何，則有待我們進一步闡明。

參考文獻：

［1］ Warlow C，Sudlow C，Dennis M，et al．Stroke［J］．Lancet，2003，362（9391）：1211－24．

［2］ Sabri M，Lass E，Macdonald R L．Early brain injury：a common mechanism in subarachnoid hemorrhage and global cerebral ische-mia［J］．Stroke Res Treat，2013，2013：394036．

［3］ Anderson M F，Blomstrand F，Blomstrand C，et al．Astrocytes and stroke：networking for survival［J］．Neurochem Res，2003，28 （2）：293－305．

［4］ Chen Y，Swanson R A．Astrocytes and brain injury［J］．Cereb Blood Flow Metab，2003，23（2）：137－49．

［5］ Brisdelli F，D′Andrea G，Bozzi A．Resveratrol：a natural poly-phenol with multiple chemopreventive properties［J］．Curr Drug Metab，2009，10（6）：530－46．

［6］ KPL B，Kosmeder J W，Pezzuto J M．Biological effects of resvera-trol［J］．Antioxid Redox Signal，2001，3（6）：1041－64．

［7］ Ren J，Fan C，Chen N．et al．Resveratrol pretreatment attenuates cerebral ischemic injury by upregulating expression of transcription factor Nrf2 and HO-1 in rats［J］．Neurochem Res，2011，36 （12）：2352－62．

［8］ 任俊偉，陳 娜，范層層，等．白藜蘆醇對腦缺血／再灌注后細胞凋亡及Caspase-3表達的影響［J］．中成藥，2011（4）：570 －3．

［8］ Ren J W，Chen N，Fan C C，et al．Effect of resveratrol on apopto-sis and expression of Caspase-3 in rats with focal cerebral ischemia and reperfusion［J］．Chin Tradit Patent Med，2011，33（4）：570 －3．

［9］ 沈長波，黃家貴，張黎黎，等．白藜蘆醇在缺血缺氧再灌注損傷不同時間窗皮質神經元氧化應激的影響［J］．第二軍醫大學學報，2013，34（7）：708－3．

［9］ Shen C B，Huang J G，Zhang L L，et al．Effect of resveratrol on oxidative stress of rat primary cortical neurons during different time windows of oxygen-glucose deprivation／reperfusion injury［J］．Acad J Second Milit Med Univ，2013，34（7）：708－13．

［10］成 薇，沈長波，王 莉，等．白藜蘆醇預處理對氧糖剝奪／再復氧損傷大鼠皮質神經干細胞增殖的影響［J］．中國藥理學通報，2015，31（1）：113－8．

［10］Cheng W，Shen C B，Wang L，et al．Effect of resveratrol pretreat-ment on proliferation of cortical neural stem cells after oxygen-glu-cose deprivation／reperfusion injury in rats［J］．Chin Pharmacol Bull，2015，31（1）：113－8．

［11］Cheng W，Yu P，Wang L M，et al．Sonic hedgehog signaling me-diates resveratrol to increase proliferation of neural stem cells after oxygen-glucose deprivation／reoxygenation injury in vitro［J］．Cell Physiol Biochem，2015，35：2019－32．

［12］Longa E Z，Weinstein P R，Carlson S，et al．Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］．Stroke，1989，20（1）：84－91．

［13］Shin J A，Lee H，Lim Y K，et al．Therapeutic effects of resvera-trol during acute periods following experimental ischemic stroke ［J］．Neuroimmunol，2010，227：93－100．

［14］Li Z，Pang L，Fang F，et al．Resveratrol attenuates brain damage in a rat model of focal cerebral ischemia via up-regulation of hipp-ocampal Bcl-2［J］．Brain Res，2012，1450，116－24．

［15］Sofroniew M V，Vinters H V．Astrocytes：biology and pathology ［J］．Acta Neuropathol，2010，119（1）：7－35．

［16］Fern R．Ischemia：astrocytes show their sensitive side［J］．Prog Brain Res，2001，132：405－11．

［17］Zhao Y，Rempe D A．Targeting astrocytes for stroke therapy［J］．Neurotherapeutics，2010，7（4）：439－51．

［18］Girbovan C，Plamondon H．Resveratrol downregulates type-1 glu-tamate transporter expression and microglia activation in the hippo-campus following cerebral ischemia reperfusion in rats［J］．Brain Res，2015：203－14．

Effects of resveratrol on astrocyte activation after cerebral ischemia／reperfusion injury in rats

YU Ping-ping，WANG Li，TANG Fan-ren，ZHOU Lu-ling，ZENG Li，
SONG Xiao-song，CHEN Ji-xiang，YANG Qin （Dept of Neurology，the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University，Chongqing 400016，China）

Abstract：Aim To investigate the effect of resveratrol on astrocyte activation after cerebral ischemia／reperfusion injury in rats．Methods 45 male Sprague-Dawley rats were divided into sham，control and resveratrol groups，15 rats in each group．Resveratrol or solvent was intra- peritoneally perfused into the rats for 7 consecutive days after 3h for MCA I／R．Cerebral infarction volume with TTC，neurological function score with Longa score，and pathological change with HE staining，the protein expressions of Caspase-3 with immunohistochemistry

at 24h after MCA I／R were examined．The protein ex-pressions of GFAP and NeuN in penumbra were detec-ted with immunohistochemistry and immunofluores-cence at 14d after MCA I／R．Results Resveratrol treatment significantly improved the neurological func-tion score，decreased the infarct volume，reduced neu-ron loss，and inhibited the activation and proliferation of astrocytes，compared with the control group．Con-clusion Resveratrol can inhibit the excessive activa-tion of astrocytes，protect neurons in penumbra and im-prove neurological function．

Key words：resveratrol；cerebral ischemia；reperfusion injury；astrocyte；neuron；activation

作者簡介：余萍萍（1988－），女，碩士生，E-mail：465430809＠qq．com；楊 琴（1970－），女，博士，教授，研究方向：腦血管疾病與干細胞移殖，E-mail：xyqh200＠126．com

基金項目：國家自然科學基金面上項目（No 81071119）；衛計委國家臨床重點專科建設項目資金資助（衛辦醫政函［2012］649號）

收稿日期：2015－05－12，修回日期：2015－06－21

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1228－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．010