干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶體外抗乙型肝炎病毒活性的研究

王愛華，管世鶴，楊 凱，張 浩，孫蓓蓓，潘 穎，沈繼龍

（安徽醫(yī)科大學(xué)1．第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科、2．人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230601）

干擾素誘導(dǎo)的雙鏈RNA依賴性蛋白激酶體外抗乙型肝炎病毒活性的研究

王愛華1，管世鶴1，楊 凱1，張 浩1，孫蓓蓓1，潘 穎1，沈繼龍2

（安徽醫(yī)科大學(xué)1．第二附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科、2．人獸共患病安徽省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，安徽合肥 230601）

中國(guó)圖書分類號(hào)：R342.2；R345.57；R373.21；R392.11；R977.3；R977.6

摘要：目的 構(gòu)建表達(dá)雙鏈RNA依賴性蛋白激酶（PKR）融合綠色增強(qiáng)熒光蛋白（pEGFP-PKR）真核表達(dá)質(zhì)粒，并進(jìn)一步研究PKR蛋白在體外抗乙型肝炎病毒（HBV）活性。方法以pEGFP-N1為空載體，運(yùn)用分子克隆技術(shù)構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PKR，通過雙酶切和直接測(cè)序兩種方法驗(yàn)證重組質(zhì)粒pEGFP-PKR是否構(gòu)建成功。以能分泌完整HBV病毒顆粒子的肝胚瘤細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞為細(xì)胞模型，采用重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染方式處理HepG2.2.15細(xì)胞，運(yùn)用熒光顯微鏡觀察融合蛋白pEGFP-PKR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)，以電化學(xué)發(fā)光方法和實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)分析細(xì)胞上清HBV抗原表達(dá)和細(xì)胞病毒復(fù)制水平。結(jié)果 酶切鑒定和序列分析證實(shí)成功構(gòu)建重組質(zhì)粒pEGFP-PKR，轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞后在熒光顯微鏡下可見融合蛋白pEGFP-PKR表達(dá)，同時(shí)細(xì)胞分泌的HBV抗原與空載體組相比較明顯下降（P＜0.05），而細(xì)胞外HBV復(fù)制水平未見明顯變化。結(jié)論 在體外肝細(xì)胞模型中，PKR蛋白具有一定的抗HBV活性作用。

關(guān)鍵詞：肝炎病毒；乙型；質(zhì)粒；PKR蛋白；抗原；復(fù)制；細(xì)胞

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．015．html

乙型肝炎病毒（hepatitis B virus，HBV）是一種嗜肝DNA病毒，HBV感染導(dǎo)致的慢性乙型肝炎對(duì)人類健康造成嚴(yán)重的危害，據(jù)報(bào)道［1－2］，HBV具有一定的致癌性，隨著病程的進(jìn)展，慢性乙型肝炎可以發(fā)展為肝硬化，甚至肝細(xì)胞癌。臨床上治療慢性乙型肝炎首選的藥物是IFN-α，IFN-α通過與細(xì)胞膜上的受體結(jié)合誘導(dǎo)表達(dá)抗病毒蛋白：如抗粘液病毒蛋白A（MxA）、蛋白激酶（PKR）、2′，5′-寡腺苷酸合成酶（2′，5′-OAS）等發(fā)揮抗病毒作用。然而，IFN-α治療慢性乙型肝炎的療效并不理想，僅有約1／3的患者有效，但具體機(jī)制尚不明。在本課題組前期研究中發(fā)現(xiàn)，HBV及其抗原成分能通過多種途徑拮抗IFN-α的抗HBV活性［3－4］，其中能被HBV核心蛋白抑制的IFN-α抗病毒蛋白MxA在體外具有抗HBV活性［5］。PKR蛋白是IFN-α誘導(dǎo)的另一種重要抗病毒蛋白。研究表明［6］，在體外肝癌細(xì)胞模型中，HBV X蛋白的表達(dá)被抑制后，PKR蛋白的表達(dá)增加，同時(shí)HBV的復(fù)制減弱。然而，針對(duì)PKR蛋白是否能夠抑制HBV活性目前尚不清楚。為此，筆者以能夠分泌HBV病毒顆粒子的HepG2.2.15細(xì)胞為細(xì)胞模型，通過構(gòu)建表達(dá)PKR蛋白融合綠色增強(qiáng)熒光蛋白（pEGFP-PKR）真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞外HBV抗原分泌和病毒復(fù)制水平，以探討PKR蛋白體外抗HBV活性，為研發(fā)新型制劑治療慢性乙型肝炎提供一定實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1　材料與方法

1．1材料來源 HepG2.2.15細(xì)胞由本實(shí)驗(yàn)室保存，細(xì)胞以含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液常規(guī)傳代培養(yǎng)。質(zhì)粒pEGFP-N1購(gòu)自美國(guó)Clon-tech公司；PKR基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司合成；LipofectamineTM2000購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；熒光定量PCR試劑盒購(gòu)自上海復(fù)星長(zhǎng)征醫(yī)學(xué)科學(xué)有限公司；電化學(xué)發(fā)光試劑盒購(gòu)自羅氏診斷產(chǎn)品上海有限公司。

1．2pEGFP-PKR質(zhì)粒構(gòu)建 從Pubmed上查找人源性基因PKR（GenBank：M852 94）的mRNA基因序列，并分別在5′端加上Xhol酶切位點(diǎn)（CTC-GAG）、3′端加上BamHI酶切位點(diǎn)（GGATCC），基因序列由上海金斯瑞生物科技有限公司合成。構(gòu)建過程如下：基因合成產(chǎn)物8 μL，T載體1 μL，solutionⅠ9 μL，4℃連接過夜。將連接產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)入感受態(tài)大腸埃希菌DH5α中，涂于含氨芐霉素的培養(yǎng)板中，并置于37℃溫箱中培養(yǎng)過夜。無菌接種環(huán)挑取4個(gè)單克隆菌落小量擴(kuò)菌，按照質(zhì)粒抽提步驟提取質(zhì)粒。取質(zhì)粒8 μL、Xhol酶0.5 μL、BamHⅠ0.5 μL，

10×HBuffer 1 μL，37℃酶切2 h，然后瓊脂糖凝膠電泳鑒定，得到目的基因與T載體連接產(chǎn)物。空載體pEGFP-N1行雙酶切，純化回收凝膠產(chǎn)物。pEG-FP-N1 3 μL、目的基因與T載體連接產(chǎn)物13 μL、T4DNA連接酶2 μL、buffer 2 μL，共20 μL，于4℃連接過夜，將產(chǎn)物全量轉(zhuǎn)入DH5α中，涂于含卡那霉素的培養(yǎng)板中，培養(yǎng)過夜。挑取陽(yáng)性克隆抽提質(zhì)粒，行雙酶切、PCR鑒定，DNA測(cè)序，最終得到pEGFP-PKR真核表達(dá)質(zhì)粒。

1．3實(shí)驗(yàn)分組 將HepG2.2.15細(xì)胞分3組，空白對(duì)照組：細(xì)胞不做相關(guān)處理，空載體組：轉(zhuǎn)染空載體pEGFP-N1，PKR轉(zhuǎn)染組：轉(zhuǎn)染重組質(zhì)粒pEGFP-PKR，每組設(shè)立3個(gè)平行對(duì)照。

1．4質(zhì)粒轉(zhuǎn)染 HepG2.2.15細(xì)胞復(fù)蘇后用10%胎牛血清，以DMEM為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，并補(bǔ)充2 mmol ·L－1谷胺酰胺、1×105U·L－1青霉素、1×105U· L－1鏈霉素、于5%CO2、37℃孵育箱培養(yǎng)。HepG2.2.15細(xì)胞用6孔板培養(yǎng)，待細(xì)胞生長(zhǎng)到70%～80%融合時(shí)，以LipofectamineTM2000為脂質(zhì)體，將不同濃度的重組質(zhì)粒pEGFP-PKR（0、2、4、6 mg·L－1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于HepG2.2.15細(xì)胞，36 h后檢測(cè)上清液中HBV抗原的表達(dá)變化；以4 mg·L－1的重組質(zhì)粒pEGFP-PKR轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞，在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)（24、36、48 h），運(yùn)用熒光顯微鏡觀察融合蛋白EGFP-PKR在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)情況及上清液中HBV抗原的表達(dá)變化。

1．5熒光定量PCR檢測(cè)細(xì)胞上清液中HBV DNA的表達(dá) 在質(zhì)粒轉(zhuǎn)染36 h后，收集各HepG 2.2.15細(xì)胞上清液，以熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)上清液中HBV DNA的量。具體步驟如下：取50 μL細(xì)胞上清液，加入50 μL核酸提取液A，振蕩混勻10 s，12 000 ×g離心10 min，棄上清；然后加入50 μL核酸提取液B至沉淀中，振蕩混勻10 s，100℃保溫10 min，12 000×g離心2 min。取處理上清液7 μL、HBV PCR緩沖液30 μL、MgCl25 μL、熒光探針5 μL、Taq 酶3 μL，共50 μL于反應(yīng)管中，低速離心數(shù)秒，取出置于PCR儀器。應(yīng)用Mx3000P PCR儀器進(jìn)行熒光定量檢測(cè)，反應(yīng)條件為：94℃預(yù)變性5 min，93℃30 s，60℃90 s，共循環(huán)40次，反應(yīng)結(jié)束后由軟件分析計(jì)算出HBV DNA的拷貝數(shù)。

1．6電化學(xué)發(fā)光法檢測(cè)HepG2.2.15細(xì)胞分泌的HBV HBsAg和HBeAg 分別收集不同時(shí)間點(diǎn)各組細(xì)胞上清液，以1 200 r·min－1離心10 min以去除細(xì)胞碎片，收集的上清液按照電化學(xué)發(fā)光試劑說明書檢測(cè)HBsAg和HBeAg。

1．7統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 用SPSS 13.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)用±s表示，采用t檢驗(yàn)和單因素方差分析。

2　結(jié)果

2．1真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-PKR的鑒定 將pEG-FP-PKR質(zhì)粒送至上海生物工程公司測(cè)序，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建正確，插入的目的基因與PKR（Gen-Bank：M85294）比較，核酸同源性為99%，見Fig 1A。重組質(zhì)粒pEGFP-PKR行Xhol酶、BamHⅠ雙酶切后，雙酶切分別得到1668 bp大小的目的片段和4651 bp大小載體，所得片段大小與預(yù)期相符合，如Fig 1B。

Fig 1 Results of pEGFP-PKR sequencing and enzyme digestion

2．2真核表達(dá)質(zhì)粒pEGFP-PKR在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)情況 質(zhì)粒pEGFP-PKR轉(zhuǎn)染HepG2.2.15細(xì)胞24 h后，在熒光顯微鏡下即可觀察到綠色熒光，轉(zhuǎn)染36 h綠色熒光強(qiáng)度最強(qiáng)，即抗病毒蛋白PKR在HepG2.2.15細(xì)胞中表達(dá)最強(qiáng)（Fig 2A）。且以胞質(zhì)表達(dá)為主，細(xì)胞核也有微量表達(dá)（Fig 2B）。

2．3PKR蛋白對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞外HBV抗原分泌的影響 將不同濃度的重組質(zhì)粒pEGFP-PKR（0、2、4、6 mg·L－1）瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于HepG2.2.15細(xì)胞36 h后，電化學(xué)發(fā)光分析顯示，與0 mg·L－1pEGFP-PKR轉(zhuǎn)染劑量組相比，其它劑量轉(zhuǎn)染組細(xì)胞外HBsAg和HBeAg分泌量均有明顯下降（P＜0.05），隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-PKR濃度的增加，HepG2.2.15細(xì)胞HBV

抗原分泌逐步降低，其中4 mg·L－1抑制效果最為明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.01），如Fig 3所示。將4 mg·L－1質(zhì)粒pEGFP-PKR瞬時(shí)轉(zhuǎn)染于HepG2.2.15細(xì)胞中，在轉(zhuǎn)染后不同的時(shí)間點(diǎn)（0、24、36、48 h）檢測(cè)細(xì)胞上清液HBV抗原的分泌，結(jié)果顯示：空載體組與空白組相比，HBV抗原分泌無明顯變化（P＞0．05）；與空載體組相比，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，PKR轉(zhuǎn)染組HBV抗原的分泌量逐漸下降（P＜0.05），其中轉(zhuǎn)染后36 h對(duì)HBsAg的抑制作用最強(qiáng)（P＜0.01），對(duì)HBeAg的抑制作用在轉(zhuǎn)染后48 h最強(qiáng)（P＜0.01），如Fig 4所示。

Fig 2 Expression of pEGFP-PKR fusion protein in HepG2.2.15 cells observed by fluorescent microscope

Fig 3 Effects of different doses of plasmid pEGFP-PKR transfection on HBV antigen secretion

2．4PKR蛋白對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞外HBV復(fù)制的影響 應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Real-time PCR）分析發(fā)現(xiàn)，與空白對(duì)照組比較，各處理組對(duì)HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV DNA無明顯抑制作用（P＞0.05），見Fig 5。

3　討論

IFN-α作為一種重要的細(xì)胞因子，具有抗病毒、抗細(xì)胞增殖和免疫調(diào)節(jié)等多種生物學(xué)功能，是臨床治療乙型肝炎的首選藥物。然而，臨床上運(yùn)用

IFN-α治療乙型肝炎的療效不甚理想，因此，尋找和研發(fā)新型的治療HBV感染的藥物和蛋白制劑非常必要。

Fig 4 Effects of pEGFP-PKR transfection on secretion of HBV antigen in different time

Fig 5 Expression of HBV DNA in supernatant of HepG2.2.15 cells by real-time fluorescence quantitative PCR

有研究報(bào)道［7－9］，PKR作為干擾素可誘導(dǎo)的環(huán)腺苷酸非依賴性絲氨酸／蘇氨酸激酶，其N端dsRBM與病毒誘導(dǎo)的dsRNA在細(xì)胞內(nèi)相結(jié)合后，進(jìn)而誘發(fā)PKR的底物蛋白eIF-2磷酸化修飾，干預(yù)病毒基因進(jìn)入宿主細(xì)胞核糖體環(huán)節(jié)，最終發(fā)揮抑制病毒復(fù)制的作用。PKR是干擾素誘導(dǎo)的一種重要的抗病毒蛋白，在IFN-α的抗HBV效應(yīng)中發(fā)揮了極其重要的作用［10］。HBV是一種嗜肝病毒，感染肝細(xì)胞后本身并不引起肝細(xì)胞損傷，而是由于特異和非特異的免疫細(xì)胞攻擊作用導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷，若能尋找到在肝細(xì)胞內(nèi)有效抑制HBV復(fù)制抗病毒蛋白，這對(duì)于慢性乙型肝炎的治療將具有積極的意義。結(jié)合課題組前期研究結(jié)果，我們推測(cè)PKR作為一種干擾素誘導(dǎo)的重要廣譜抗病毒蛋白，很可能對(duì)HBV抗原分泌或病毒復(fù)制具有一定抑制作用。為此，在本研究中，通過構(gòu)建表達(dá)PKR蛋白的綠色增強(qiáng)熒光蛋白-PKR（pEGFP-PKR）真核表達(dá)質(zhì)粒，將其轉(zhuǎn)染能分泌完整HBV病毒顆粒子的肝胚瘤細(xì)胞株HepG2.2.15細(xì)胞，分析轉(zhuǎn)染前后不同時(shí)間點(diǎn)和轉(zhuǎn)染劑量對(duì)肝細(xì)胞外HBV抗原分泌和病毒復(fù)制水平影響，以研究PKR蛋白體外是否具有抗HBV活性。結(jié)果顯示，抗病毒融合蛋白PKR主要在HepG2.2.15細(xì)胞胞質(zhì)表達(dá)，細(xì)胞核有微量表達(dá)，隨著轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pEGFP-PKR劑量的增多，HepG2.2.15細(xì)胞HBV抗原分泌逐步降低，直至4 mg·L－1抑制效果最為明顯，而在6 mg·L－1對(duì)HBV抗原抑制效果不如4 mg·L－1，很可能是由于高劑量轉(zhuǎn)染濃度增加轉(zhuǎn)染試劑對(duì)肝細(xì)胞的細(xì)胞毒作用。然而，HepG2.2.15細(xì)胞上清液中HBV復(fù)制水平并未有明顯變化，這與我們前期報(bào)道IFN抗病毒蛋白脫離宿主體內(nèi)免疫系統(tǒng)的參與會(huì)影響其抗病毒活性的結(jié)論是一致的［11］。此外，PKR抗病毒蛋白抗HBV活性也呈現(xiàn)一定時(shí)間依賴性，隨著轉(zhuǎn)染時(shí)間延長(zhǎng)，PKR抗病毒蛋白抗HBV活性逐步升高，其中轉(zhuǎn)染后36 h 對(duì)HBsAg的抑制作用最強(qiáng)，對(duì)HBeAg的抑制作用在轉(zhuǎn)染后48 h最強(qiáng)。然而本研究中，PKR轉(zhuǎn)染組HBV DNA與對(duì)照組相比差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，這與體內(nèi)有關(guān)抗病毒蛋白具有較好的抗HBV活性報(bào)道不相符，可能是由于抗病毒蛋白對(duì)HBV DNA復(fù)制的抑制作用需要體內(nèi)免疫系統(tǒng)的參與，而體外細(xì)胞模型缺乏體內(nèi)復(fù)雜的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)，因此不能表現(xiàn)出良好的抗HBV復(fù)制作用。

本研究表明，在體外，PKR蛋白具有一定獨(dú)立的抗HBV活性，且主要在肝細(xì)胞胞質(zhì)發(fā)揮作用，本研究為PKR蛋白的抗病毒作用及臨床運(yùn)用PKR蛋

白制劑治療慢性乙型肝炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)，但是如何讓體外實(shí)驗(yàn)在人體內(nèi)得到驗(yàn)證還需要進(jìn)一步的探討，下一步的研究擬以感染HBV的小鼠為動(dòng)物模型，在體內(nèi)驗(yàn)證PKR蛋白是否能夠有效的發(fā)揮抗HBV活性。隨著進(jìn)一步的研究，PKR蛋白可望單獨(dú)或與其它抗病毒藥物（如IFN-α）一起運(yùn)用于乙型肝炎的臨床治療，為乙肝病人提供新的治療選擇。

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Study of IFN-inducible double-stranded RNA dependent protein kinase on antiviral activity of HBV in vitro

WANG Ai-hua1，GUAN Shi-he1，YANG Kai1，ZHANG Hao1，SUN Bei-bei1，PAN Ying1，SHEN Ji-long2
（1.Dept of Clinical Laboratory，the Second Affiliated Hospital of Anhui Medical University，Hefei 230601，China；2．Anhui Key Laboratories of Zoonoses，Anhui Medical University，Hefei 230601，China）

Abstract：Aim To construct and express the eukary-otic expression vector of double-stranded RNA-depend-ent protein kinase（PKR）fusion green fluorescent and analyse its antiviral activity of HBV in vitro．Methods The PKR gene was cloned into an empty expression vector pEGFP-N1 using molecular clone technology．After being confirmed by restriction enzyme digestion and sequencing methods，the recombinant plasmid was named as pEGFP-PKR that was subsequently transfect-ed into HepG2.2.15 cells using LipofectamineTM2000．The expression level of PKR in HepG2.2.15 cells was confirmed by using fluorescent microscopy．Mean-while，HBV DNA and HBsAg／HBeAg were detected by real-time PCR and electrochemiluminescence meth- od，respectively．Results Both restriction enyme di-gestion and sequencing assays showed that the recombi-nant vector pEGFP-PKR was successfully constructed in our study．Fluorescent microscopy observation indi-cated that the fusion protein pEGFP-PKR expressed ef-ficiently in HepG2.2.15 cells．Moreover，compared with the empty vector group，the expression of HBV antigen in supernatants was significantly decreased（P ＜0.05）．However，the extracellular HBV DNA ex-pression was not inhibited significantly．Conclusion In vitro，PKR proteion has certain antiviral activity of HBV．

Key words：hepatitis B virus；plasmid；PKR protein；antigen；complication；cells

作者簡(jiǎn)介：王愛華（1985－），女，碩士，檢驗(yàn)師，E-mail：314wcy＠163．com；管世鶴（1972－），男，博士，教授，主任技師，博士生導(dǎo)師，通訊作者，E-mail：shiheguan＠126．com

基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目（No 81171662）

收稿日期：2015－05－09，修回日期：2015－06－29

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1254－05

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．015