蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性內皮祖細胞中的促血管新生作用

劉 暖，楊 雷，毛秉豫，徐國昌，葉松山，張培華，張?芳

（南陽理工學院醫學實驗中心，河南南陽 473004）

蛋白激酶D1在大鼠骨髓源性內皮祖細胞中的促血管新生作用

劉 暖，楊 雷，毛秉豫，徐國昌，葉松山，張培華，張?芳

（南陽理工學院醫學實驗中心，河南南陽 473004）

中國圖書分類號：R-332；R329．24；R345．44；R345.57；R364.3；R977.3

摘要：目的 探討蛋白激酶D1（PKD1）對大鼠骨髓源性內皮祖細胞（EPCs）黏附、遷移、增殖、血管形成能力及內皮型一氧化氮合成酶（eNOS）表達的影響。方法 體外培養、分離和鑒定大鼠骨髓源性EPCs，觀察PKD1及其特異性阻斷劑CID755673對EPCs的黏附、遷移、增殖、血管形成能力的影響，以及對EPCs中eNOS的mRNA表達和蛋白表達的影響。結果 EPCs體外細胞培養實驗表明，PKD1可明顯促進EPCs的黏附、遷移和增殖，提升EPCs的血管形成能力，上調EPCs中eNOS的mRNA表達和蛋白表達水平。結論 PKD1具有調控EPCs促血管新生的作用，其促血管新生的作用可能以一種依賴eNOS的方式進行。

關鍵詞：蛋白激酶D1；內皮祖細胞；血管新生；內皮型一氧化氮合成酶；遷移；增殖

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．016．html

蛋白激酶D（protein kinase D，PKD）屬于進化上高度保守的鈣／鈣調蛋白依賴性的絲氨酸／蘇氨酸激酶家族，其重要家族成員之一PKD1參與很多基礎的生物進程調節，包括信號轉導、細胞的增殖和分化、跨膜轉運、分泌、免疫調節、心肌細胞的收縮、血管新生、腫瘤等［1］。特別是PKD1在腫瘤形成的進程中倍受關注，PKD1信號級聯反應和胰腺癌、肝癌、胃癌、腸癌、乳腺癌、前列腺癌等的發生發展密切相關［2］，其原因在于PKD1既可以直接促進癌細胞的增殖和分化，又促進癌細胞生長區域血管的新生。鑒于此，抗PKD1抑制腫瘤的方法在胰腺癌、乳腺癌等治療中已經被提出，如特異的PKD1抑制劑CRT0066101可以明顯抑制小鼠胰腺癌腫瘤細胞的增生［2］。

近年來，在缺血性心血管系統疾病的治療中，內皮祖細胞（endothelial progenitor cells，EPCs）療法是潛在的最有希望的治療策略之一，其可以被誘導分化為心肌細胞和血管平滑肌細胞［3］，實現缺血損傷心肌組織真正意義上的血管新生。PKD1既然可以促進腫瘤細胞的增殖和腫瘤組織中血管的新生，那么是否也可能有促進EPCs黏附、遷移、增殖，誘導EPCs分化為血管的作用？本研究擬對此進行探討并分析其可能作用機制，為以“PKD1”這一潛在可能靶點治療缺血性心血管疾病提供新的思路。

1　材料與儀器

1．1實驗動物 SD大鼠購自河南省實驗動物中心，♂，清潔級，8周齡，重約200～240 g，動物生產許可證號：SCXK（豫）2010－0002，動物質量合格證號：1000142。

1．2藥物與試劑 PKD1購自美國Pierce公司（生產批號為OSP00005W），PKD1特異阻斷劑CID755673購自美國MedChemExpress公司（生產批號為2011756），DNA酶I、Dulbecco′s PBS、FBS、膠原酶I、BrdU、BrdU鼠單克隆抗體購自上海寶曼生物科技有限公司（生產批號分別為LS002004、28374、SH30077、LS004194、83224、MMS-139S-250）；EBM-2培養基購自北京達科為生物技術有限公司（生產批號為CC-3156）；CD133、CD34、eNOS、VEGFR-2抗體購自天津恒業生物科技有限公司（生產批號為EL910835、EL162014、EL163112和EL171852）；羊抗兔IgG、DAB顯色液購自武漢博士德生物工程有限公司（生產批號為TC1378、DD1660）；FN、FITC和DAPI購自北京碧橙藍生物科技有限責任公司（生產批號為PA127507、PA185438和62247）；其它試劑為國產分析純。

1．3主要儀器 A2-1389型生物安全柜（美國Thermo Scientific公司）；164-5052型PowerPac HC

電泳儀及FACSCanto II型流式細胞儀（美國BIO-RAD公司）；Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀（美國Next Advance公司）；Nikon Tis型熒光顯微鏡及Nikon NIS-Elements Software BR分析系統（日本尼康公司）。

2　方法

2．1EPCs的體外分離、培養和鑒定 取體重為200～240 g的健康♂SD大鼠，頸椎脫臼處死后，75%乙醇浸泡10 min，無菌操作環境下取出脛腓骨，用含肝素及DNA酶I的Dulbecco′s PBS反復沖洗骨髓，收集骨髓液，小心置入等量的淋巴細胞分離液之中，1 700 r·min－1離心30 min，無菌毛細吸管吸取分離液中間白膜層，5×PBS重懸細胞，離心后再用含2%FBS的EBM-2培養基重懸，按每平方厘米105個標準接種于培養板中，24 h后將未貼壁的細胞懸液轉入預先用50 mg·L－1FN包被的6孔細胞培養板中培養，3 d后換第1次液，之后每隔3 d換液1次，倒置顯微鏡下進行細胞形態學觀察，7－10 d后，待細胞融合80%后，采用膠原酶Ⅰ消化后傳代培養。對培養的內皮細胞觀察其生長狀態，分別在4、7、10、14 d照相并記錄。對新分離的骨髓單核細胞進行滴片，于d 4、7、10、14取生長良好的原代細胞，重懸于PBS中，分別與EPCs細胞表面標記物CD133、CD34、VEGFR-2結合，再用FITC染色，DAPI復染，檢測上述標記物陽性表達的細胞。

2．2PKD1對EPCs黏附的影響 提前用50 mg· L－1FN包被細胞培養板，每孔再接種5×104個EPCs，培養過夜，形成單皮層后轉入無血清培養基培養5 h，用鈣黃綠素標記EPCs后的制備單細胞懸液，37℃下孵育30 min。實驗分5個組：A組，空白對照組；B組，25 μg·L－1PKD1干預組；C組，50 μg ·L－1PKD1干預組；D組，100 μg·L－1PKD1干預組；E組，PKD1（100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1）干預組，以下簡稱CID755673干預組。每組設置6個復孔，實驗重復3次。各組干預后，在37℃下、5%CO2孵箱中孵育30 min，用PBS輕輕沖洗細胞，去除未黏附細胞，倒置顯微鏡40×下，隨機取6個視野拍照，計數黏附細胞個數，取平均值。

2．3PKD1對EPCs遷移的影響 用8 μm孔徑的24孔transwell進行遷移實驗，先分別在細胞小室的上、下室加入50 mg·L－1FN，再注入含2%FBS的EBM-2培養基。然后在上室按照每孔2×104個的密度接種EPCs，在下層加入A組：空白對照EBM-2；B-D組：PKD1（25、50、100 μg·L－1）；E組：PKD1 （100 μg·L－1）＋CID755673（100 μg·L－1），每組設置6個復孔，實驗重復3次。培養24 h后，用棉簽擦去上室內的細胞，2%多聚甲醛固定，Giemsa染色，40×下隨機取6個視野，倒置顯微鏡下計數遷移過膜的細胞數量，取平均值。

2．4PKD1對EPCs增殖的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎培養基重懸，每孔104個加入96孔培養板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養基培養，每孔加入終濃度為10 μmol·L－1的BrdU孵育。實驗分組同“2.2”。分別在培養的24、48和72 h后，每孔加入100 μL的BrdU鼠單克隆抗體（1∶100）室溫孵育1 h后，wash buffer沖洗2次，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后，wash buffer再次沖洗2次，加入100 μL TMB過氧化物酶底物室溫避光孵育30 min，加入100μL終止液，酶聯免疫檢測儀450 nm波長處讀取各孔吸光度值（A450），取其平均值。

2．5PKD1對EPCs血管形成能力的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎培養基重懸，每孔5×104個加入Matrigel-Matrix預處理的48孔培養板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養基培養。實驗分組同“2.2”。在培養的72 h后，40×倒置顯微鏡下觀察管狀結構數量，隨機選擇6個視野照相，取其平均值。

2．6PKD1對EPCs中eNOS mRNA轉錄表達的影響 將EPCs用含2%FBS的EBM-2的基礎培養基重懸，每孔105個加入6孔培養板中，待細胞貼壁后，更換無血清培養基培養。實驗分組同“2．2”。在培養24 h后，TRIzol法提取EPCs總RNA，根據GenBank序列，分別設計eNOS的上下游引物為5′-CTGCTGCCCCAGATATCTTC-3′和5′-CAGGTACTG-CAGTCCCTCCT-3′，產物長度為230bp。每組細胞取2μg總RNA，根據試劑盒的說明書逆轉錄合成cD-NA，再取2 μg逆轉錄產物進行普通PCR，94℃，1 min，95℃，30 s，54℃，1 min，72℃，1 min，30個循環，延伸2 min。取反應產物10 μg進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳，EB染色后AlphaView SA軟件攝圖，并分析eNOS與β-actin基因的灰度比值。

2．7PKD1對EPCs中eNOS蛋白表達的影響細胞培養實驗設計同“2.6”。應用Next Advance Bullet Blender Storm組織細胞破碎儀將EPCs打碎，勻漿，4℃下12 000×g離心2min，提取組織總蛋白后Bradford法測定蛋白濃度，取其中20 μg蛋白進行12%的SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉移至硝酸纖維素膜上，5%的脫脂奶粉封閉2 h后洗膜，標記1∶250稀釋的eNOS一抗，4℃過夜，洗膜，與辣根過

氧化物酶標記的羊抗小鼠IgG（1∶2 000稀釋）孵育1 h后TBST洗膜，沖洗后暗室曝光顯影。同時以β-actin蛋白表達水平作為內參對照。膠片經成像分析系統掃描，并應用AlphaView SA軟件分析各樣本與β-actin蛋白灰度的比值，記錄蛋白相對含量。

2．8統計學處理 采用SPSS 16．0統計軟件系統，計量資料以±s表示，多組間均數比較比較用單因素方差分析，組間多重比較用SNK-q檢驗。

3　結果

3．1EPCs的鑒定 EPCs結合FITC后呈現綠色，DAPI復染后胞核呈藍色。EPCs呈卵圓形、紡錘形或者不規則狀，CD133、CD34或VEGFR-2表達陽性，見Fig 1。

Fig 1 Immunofluorescence detection of CD34（A／D），VEGFR-2 （B／E）and CD133（C／F）for EPCs（×200）

3．2PKD1對EPCs黏附、遷移能力的影響 和對照組相比，PKD1各干預組促EPCs黏附、遷移的能力明顯增強（P＜0.05），且呈劑量依賴性（F黏附＝21.323，F遷移＝18.586，均P＜0.05）。加入CID755673干預之后，EPCs的黏附、遷移的能力明顯下降（P＜0.05）。見Fig 2。

3．3PKD1對EPCs增殖能力的影響 和對照組相比，24、48、72 h PKD1各劑量組促EPCs的增殖能力均明顯升高（P＜0.05），且隨劑量增加促增殖能力呈上升趨勢；加入CID755673干預之后，EPCs的增殖能力明顯下降（P＜0.05）。24、48、72 h時間組組間相比，隨時間推移，PKD1各劑量組促EPCs增殖能力均明顯升高（F時間＝7.137，P＜0.05）；且時間和劑量均明顯影響EPCs增殖（F交互＝10.098，P＜0.05）。見Fig 3。

Fig 2 Effect of PKD1 on migration and adherence in EPCs

Fig 3 Effect of PKD1 on proliferation in EPCs

3．4PKD1對EPCs血管形成能力的影響 與對照組相比，PKD1各干預組EPCs管腔樣結構的數目明顯增加（P＜0.05），且呈劑量依賴性增加趨勢。加入CID755673干預之后，EPCs管腔樣結構的數目明顯減少（P＜0.05），且管狀結構結點模糊。見Fig 4。

Fig 4 Effect of PKD1 on numbers of tube-like structures in EPCs

3．5PKD1對EPCs中eNOS mRNA及蛋白表達的影響 和對照組相比，PKD1各干預組EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），和25 μg·L－1PKD1干預組相比，50及100 μg·L－1PKD1干預組EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達水平均明顯升高（P＜0.05），但后兩組組間比較無差異；加入CID755673干預之后，EPCs中eNOS mRNA和蛋白表達水平均明顯降低（P＜0.05）。見Fig 5－6。

4　討論

Fig 5 Effect of PKD1 on mRNA expression of eNOS in EPCs

Fig 6 Effect of PKD1 on protein expression of eNOS in EPCs

本研究結果從PKD1激活和阻斷兩方面均證實PKD1明顯促進EPCs的黏附和遷移，且呈劑量依賴性。這可能與PKD1對細胞間黏附分子l（intercellu-lar adhesion molecule 1，ICAM-1）和血管細胞黏附分子l（vascular cell adhesion molecule l，VCAM-1）的活化作用密切相關。ICAM-1和VCAM-1介導EPCs之間的黏附、趨化因子誘導的EPCs跨內皮的遷移，而黏附和遷移是歸巢過程中的重要環節［3］。本研究結果同時證實，在24、48、72 h不同時間段，PKD1各劑量干預組均明顯增加EPCs的增殖，且呈時間依賴性，時間和劑量方差交互分析證實兩者均明顯影響EPCs的增殖。這表明，PKD1可以明顯促進EPCs的增殖。進一步的研究結果表明，PKD1呈劑量依賴性提升EPCs的管腔樣結構數量。之前的研究證實EPCs向缺血組織歸巢，分化為成熟的內皮細胞，并通過旁分泌的方式調控現存的內皮細胞，以一種和胚胎時期血管形成相似的方式分化成為血管內皮細胞，進而形成血管［4］。同時，PKD1還可以誘導生成多種生長因子，聯合發揮作用，參與血管新生和組織再生的整個修復進程［5］。這和我們的研究結果高度吻合。這表明，PKD1可以通過調控EPCs的黏附、遷移、增殖以及血管形成能力，促進受損組織區域內微血管的新生，而在缺血性心肌組織損傷

修復的進程中發揮著重要的作用。

本研究還分別從PKD1激活和阻斷兩個截然相反的角度證實PKD1可以明顯上調EPCs中eNOS 的mRNA和蛋白表達水平。eNOS和其產物NO在血管系統的穩態維持中扮演著重要的角色，不僅調控著血壓水平、血管的緊張度，而且發揮著重要的抗炎、抗氧化、抗血栓形成效應［6］。eNOS的激活是通過1179的絲氨酸激活位點，Akt、CaMKII、AMPK、PKD1均可以通過這一位點而激活eNOS［7－8］。之前的文獻報道，在VEGF介導的eNOS激活的進程中，PKD1是必不可少的［9］。也有學者認為，eNOS屬于新發現的PKD的底物，因為eNOS被各種氨基酸識別結合激活的位點恰恰均存在于現有報道的PKD底物之內，采用PKD1阻斷劑或者基因沉默PKD1均可以以一種依賴eNOS的方式阻斷動脈內皮細胞的遷移，減緩受損傷口的愈合［10］。和上述結果相似，我們的研究也表明，PKD1可能以一種依賴eNOS的方式促進EPCs的黏附、遷移、增殖和血管形成。

當前在缺血性心臟病的臨床治療進程中，由于心肌細胞分化和增殖能力極差，心肌組織缺血受損后通常以纖維組織進行疤痕修補，這對修復后的心臟功能產生較大的損害作用［11］。本研究結果對于后續的骨髓源性EPCs移植至心肌梗死大鼠動物模型或者心肌梗死患者受損的心肌組織中，促缺血區域局部血管的新生，以及干預PKD1誘導EPCs分化為內皮細胞，促內皮細胞遷移，減輕或者逆轉損傷心肌組織纖維化修復進程，促損傷心肌組織心功能狀態的恢復有積極的參考意義。

（致謝：本文的實驗在南陽理工學院醫學實驗中心完成，實驗由楊雷博士和毛秉豫教授共同設計，并進行經費資助。劉暖為實驗的主要完成人，徐國昌主要負責統計學工作，葉松山、張培華、張?芳協助進行分子生物學實驗。對以上同志的工作特別表示感謝！）

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Angiogenesis of protein kinase D1 in bone marrow-derived endothelial progenitor cells of rats

LIU Nuan，YANG Lei，MAO Bing-yu，XU Guo-chang，YE Song-shan，ZHANG Pei-hua，ZHANG Li-fang
（Medical Experimental Center，Nanyang Institute of Technology，Nanyang Henan 473004，China）

Abstract：Aim To explore the effect of protein kinase D1（PKD1）on adherence，migration，proliferation，microvascular formation，and eNOS expression in bone marrow-derived endothelial progenitor cells（EPCs）of rats．Method The EPCs were isolated from bone marrow of rats，cultured and detected，the effects of PKD1 and its specific blocking agent CID755673 on adhesion，migration，proliferation，or microvascular formation were observed，as well as mRNA and protein expression of endothelial nitric oxide synthase（eNOS）

in EPCs．Results PKD1 significantly promoted adhe-sion，migration，proliferation and microvascular forma-tion of EPCs，and upregulated the mRNA and protein expression of eNOS in EPCs，according to the cell cul-ture experiments of EPCs in vitro．Conclusion PKD1 has the role of angiogenesis through regulation of EPCs，which might be dependent on eNOS．

Key words：protein kinase D1；endothelial progenitor cells；angiogenesis；endothelial nitric oxide synthase；migration；proliferation

作者簡介：劉 暖（1987－），女，碩士，助教，研究方向：心血管疾病發病機制，E-mail：liunuan2006＠126．com；楊 雷（1977－），男，博士，副教授，研究方向：中西醫結合抗心血管疾病發病機制，Tel：0377-62071309，E-mail：yanglei200609＠126．com；毛秉豫（1958－），男，博士，教授，研究方向：心血管疾病的氣血并治方藥，Tel：0377-62071305，E-mail：maobing yu2005＠126．com

基金項目：國家自然科學基金資助項目（No 81473438，81202791，81173372）；河南省中醫內科學重點學科支撐課題（豫教高［2012］186號）

收稿日期：2015－05－13，修回日期：2015－06－23

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1259－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．016