蛇床子素可能通過上調PPARα和PPARγ的表達減輕野百合堿所致大鼠右心室重構

李葉麗，王穎婉，李意奇，王俊逸，楊丹莉

（遵義醫學院藥理學教研室，基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000）

蛇床子素可能通過上調PPARα和PPARγ的表達減輕野百合堿所致大鼠右心室重構

李葉麗，王穎婉，李意奇，王俊逸，楊丹莉

（遵義醫學院藥理學教研室，基礎藥理省部共建教育部重點實驗室，貴州遵義 563000）

中國圖書分類號：R-332；R284．1；R322．11；R392．11；R543.2；R544

摘要：目的 探討蛇床子素（osthole，Ost）對野百合堿（MCT）所致大鼠右心室重構的作用及其可能的機制。方法 ♂SD大鼠隨機分為正常對照組、模型組、Ost低劑量組（10 mg· kg－1）和Ost高劑量組（20 mg·kg－1）。后3組大鼠經頸背部一次性皮下注射MCT 50 mg·kg－1建立右心室重構模型，Ost低、高劑量組于造模后d 1開始給藥（ig，qd）。給藥28 d后稱大鼠右心室自由壁重量（RV）和左心室加室間隔重量（LV＋SEP），計算右心室肥大指數（RVHI＝RV／LV＋SEP）；通過HE染色觀察右心室形態學變化；Western blot檢測右心室PPARα和PPARγ蛋白的表達。結果 與正常對照組相比，模型組大鼠RVHI明顯升高（P＜0.05）；右心室心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大畸形，胞質明顯腫脹；PPARα和PPARγ蛋白的表達明顯下調（P＜0.05）。與模型組相比，Ost低、高劑量組大鼠RVHI明顯降低（P＜0.05）；右心室心肌細胞排列較為整齊；PPARα和PPARγ蛋白的表達明顯上調（P＜0.05）。結論 Ost具有改善MCT所致大鼠右心室重構的作用，其機制可能至少部分與其上調PPARα和PPARγ的表達有關。

關鍵詞：蛇床子素；野百合堿；右心室肥大指數；右心室重構；過氧化物酶體增殖物激活受體α；過氧化物酶體增殖物激活受體γ

網絡出版時間：2015－8－10 14：37 網絡出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．018．html

右心室重構及右心衰竭是肺動脈高壓患者死亡的主要原因之一［1］，逆轉右心室重構，尋找有效的治療藥物具有重要意義。目前認為，導致右心室重構的原因主要有心肌細胞肥大、凋亡、炎性因子浸潤及過氧化物酶體增殖物激活受體（peroxisome prolif- erator activated receptor，PPAR）被抑制等［2］。其中，PPARs表達的降低可導致心肌脂質和能量代謝紊亂，炎性因子生成增多，促進心室重構的發生［3］。野百合堿（monocrotaline，MCT）所致肺動脈高壓繼發的右心室重構模型是目前常用的右心室重構模型［4］。

蛇床子素（osthole，Ost）又名甲氧基歐芩酚、歐芹酚甲醚，是從傘形科蛇床的干燥成熟果實中提取的一種香豆素類化合物，具有抗炎、抗心律失常、抗腫瘤、抗骨質疏松癥等作用［5］。已有研究表明，Ost在異丙腎上腺素所致的心肌纖維化病變中能上調PPARγ的表達［6］。因此，本研究采用MCT誘導的右心室重構模型，觀察Ost對MCT誘導的右心室重構的作用，并探討其可能的機制，為Ost的開發利用提供基礎藥理學依據。

1　材料與方法

1．1藥品、試劑及主要儀器 Ost（純度≥98%，南京澤朗醫藥科技有限公司）；MCT（Sigma公司）；PPARα、PPARγ兔抗大鼠抗體（美國Abcam公司）；辣根過氧化物酶（HRP）標記的GAPDH抗體（上?？党缮锕こ逃邢薰荆?；HRP標記的山羊抗兔IgG（英國CST公司）；BCA蛋白濃度測定試劑盒、ECL＋發光劑（江蘇碧云天生物技術研究所）；Leica光學顯微鏡及照相系統（德國Leica Microsystems Ltd）；Mini-PROTEAN3電泳儀、Mini Trans-Blot轉移系統、CCD成像系統（美國BIO-RAD公司）。

1．2實驗動物 （200～220）g，♂，SD大鼠，清潔級，由第三軍醫大學大坪醫院實驗動物中心提供，許可證號：SCXK（渝）2012－0005。

1．3主要溶液的配制

1．3．1低劑量Ost的配制 稱取0.1 g Ost，滴0.25 mL吐溫80助溶，加ddH2O溶至50 mL，混勻。

1．3．2高劑量Ost的配制 稱取0.2 g Ost，滴0.25 mL吐溫80助溶，加ddH2O溶至50 mL，混勻。

1．3．3MCT的配制 稱取0.5 g MCT溶于10 mL 0.5 mol·L－1的HCl中，用0.5 mol·L－1的NaOH 調pH至7.4，加生理鹽水定容至50 mL。

1．4分組、造模及給藥 所有大鼠適應性飼養1周后，隨機選取10只，經頸背部一次性皮下注射生理鹽水5 mL·kg－1作為正常對照組（Control），其余大鼠均經頸背部一次性皮下注射MCT（5 mL· kg－1）建立右心室重構模型，造模后將大鼠隨機分為3組。分組情況如下：模型組（Model，n＝15），Ost低、高劑量組（Ost-L、Ost-H，10、20 mg·kg－1，n＝10）。其中，Ost-L、Ost-H劑量組于造模后d 1開始給藥（5 mL·kg－1，ig，qd），Model組和Control組給予加有等量吐溫80的ddH2O（5 mL·kg－1，ig，qd），至28 d。

1．5右心室肥大指數的測定 給藥28 d后，稱大鼠體重，予質量濃度為70 g·L－1的水合氯醛腹腔注射麻醉成功后打開胸腔，取出心臟，置于預冷的生理鹽水中洗凈，分離右心室游離壁，濾紙吸干表面水分，分別稱取右心室重量（right ventricle，RV）和左心室加室間隔重量（left ventricle plus septum，LV＋SEP），計算右心室肥大指數［RV hypertrophy index，RVHI＝RV／（LV＋SEP）］。

1．6右心室形態學觀察 取約3 mm心肌組織，置于體積分數為0.04的甲醛溶液中，固定48 h后脫水、包埋、行HE染色，光鏡下觀察右心室形態學變化。

1．7右心室PPARα和PPARγ蛋白的檢測 取各組大鼠右心組織約100 mg，剪碎后置于1 mL含有蛋白酶抑制劑的蛋白裂解液中，冰上勻漿提取總蛋白，BCA法對蛋白定量。SDS-PAGE凝膠電泳分離后，采用恒流220 mA分別濕轉110、120和72 min，將PPARα、PPARγ、GAPDH蛋白轉至PVDF膜上，用質量濃度為50 g·L－1的脫脂奶粉室溫封閉2 h，分別放入相應的一抗稀釋液中，PPARα（1∶1 000），PPARγ（1∶800），GAPDH（1∶5 000），4℃過夜，PPARα和PPARγ室溫孵育二抗（1∶2 000）1 h，暗室曝光，采用Quantity One定量分析軟件進行灰度分析。

1．8統計學分析 實驗數據按完全隨機對照要求收集整理，以±s表示，采用SPSS 16.0軟件進行ONE-WAY ANOVA處理，方差齊用LSD法，方差不齊用Dunnett，T2法。

2　結果

2．1Ost對大鼠RVHI的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠RVHI明顯升高（P＜0.05）。與模型組相比，Ost-L、Ost-H劑量組大鼠RVHI降低（P＜0.05）。見Tab 1。

2．2Ost對大鼠右心室形態學的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠右心室心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大畸形，胞質明顯腫脹。與模型組相比，Ost-L、Ost-H劑量組大鼠心肌細胞排列較為整齊，胞質無明顯腫脹。見Fig 1。

Tab 1 Effect of Ost on MCT induced RVHI in rats（±s，n＝6～8）

Tab 1 Effect of Ost on MCT induced RVHI in rats（±s，n＝6～8）

＃P＜0.05 vs control；*P＜0.05 vs model

Group　Dose／mg·kg－1RV／g　LV＋SEP／g　RVHI Control?。?．138±0．025 0．547±0．103　0．254±0．022 Model　－　0．289±0．053 0．596±0．072　0．484±0．111＃Ost-L　10　0．204±0．032 0．518±0．036　0．390±0．057*Ost-H　20　0．183±0．025 0．520±0．027　0．352±0．061*

Fig 1 Effect of Ost on right ventricular morphology induced by MCT in rats（×400）

2．3Ost對大鼠右心室PPARα和PPARγ蛋白表達的影響 與正常對照組相比，模型組大鼠右心室PPARα、PPARγ蛋白的表達明顯下調（P＜0.05）。與模型組相比，Ost-L、Ost-H劑量組右心室PPARα、PPARγ蛋白的表達均上調（P＜0.05）。見Fig 2。

3　討論

MCT誘導的右心室重構模型是目前公認的制備右心室重構的模型之一［4］。MCT經肝代謝后生成野百合堿吡咯，可誘發右心室重構。該模型具有操作簡單、模型穩定等優點。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠右心室肥大指數（RVHI）明顯升高；右心室心肌細胞排列紊亂，心肌細胞肥大畸形，胞質明顯腫脹，提示造模成功。與模型組相比，Ost-L、Ost-H劑量組大鼠RVHI降低；右心室心肌細胞排列較為整齊，胞質無明顯腫脹，提示Ost具有改善MCT所致大鼠右心室重構的作用。

過氧化物酶體增殖物激活受體（PPARs）是一類由配體激活的核轉錄因子超家族成員，有PPARα、PPARβ和PPARγ 3種亞型［7］。其中，PPARα主要

調節心肌脂肪和能量代謝，通過調控基因編碼線粒體脂肪酸β-氧化途徑，為心臟提供ATP，起到保護心肌的作用［8］。PPARγ是一種重要的細胞分化轉錄因子，被其配體激活后，可與維甲酸x受體結合形成異源二聚體，轉移到細胞核，與特定的應答元件結合，啟動目標基因表達，主要控制糖脂代謝，參與細胞凋亡、炎癥等病理過程，發揮抗炎作用［9－10］。因此，通過上調PPARα和PPARγ的表達可能對心室重構具有保護作用。本研究結果顯示，與正常對照組相比，模型組大鼠右心室PPARα和PPARγ蛋白的表達明顯下調，說明在MCT誘導的右心室重構中PPARα 和PPARγ被抑制。與模型組相比，Ost-L、Ost-H劑量組大鼠右心室PPARα和PPARγ蛋白的表達明顯上調，提示Ost可能通過上調PPARα和PPARγ的表達減輕MCT所致大鼠右心室重構的發生。

Fig 2 Effect of Ost on expression of PPARα and PPARγ protein in right ventricle of rats induced by MCT（n＝3）

綜上所述，Ost具有改善MCT所致大鼠右心室重構的作用，其機制可能與其上調PPARα和PPARγ的表達有關。為進一步確證該機制，筆者后期將通過采用體外心肌細胞肥大模型，配合使用PPARα和PPARγ的特異性激動劑、阻滯劑等工具藥干預，繼續探討其機制。

（致謝：本文所有實驗均在遵義醫學院基礎藥理省部共建教育部重點實驗室完成。）

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Osthole could attenuate right ventricle remodeling in monocrotaline-treated rats by up-regulating PPARα and PPARγ

LI Ye-li，WANG Ying-wan，LI Yi-qi，WANG Jun-yi，YANG Dan-li
（Dept of Pharmacology and the Key Laboratory for Basic Pharmacology of Ministry of Education，Zunyi Medical College，Zunyi Guizhou 563000，China）

Abstract：Aim To explore the effect of Osthole（Ost）on the right ventricle remodeling in monocrot-

alinetreated rats and the possible mechanism．Meth-ods ♂SD rats were randomly divided into normal control group，model group，low dose of Ost treatment group（10 mg·kg－1）and high dose of Ost treatment group（20 mg·kg－1）．All rats were given a single dose of MCT 50 mg·kg－1subcutaneously to establish the right ventricle remodeling except normal control group．Then the rats in Ost treatment group were ga-vaged once daily．After 28 days of administration，the right ventricle（RV）and left ventricle plus septum（LV ＋SEP）were weighed separately．RV hypertrophy in-dex（RVHI）were measured by the relative weight rati-o of RV to LV＋SEP．The morphological changes of right ventricle were executed by HE staining．The pro-tein expression of PPARα and PPARγ were detected by Western blot．Results Compared with the control group，RVHI was increased obviously（P＜0.05），myocardial hypertrophy and structure disorders were observed in model group．The protein expression of PPARα and PPARγ were down-regulated significantly in model group（P＜0.05）．Compared with the model group，the value of RVHI（P＜0.05），myocardial hy-pertrophy，structure disorders were improved signifi-cantly in Ost treatment group．The protein expression of PPARα and PPARγ were up-regulated in Ost treat-ment group（P＜0.05）．Conclusion Ost can attenu-ate the right ventricle remodeling induced by MCT in rats，which may be related to up-regulating the expres-sion of PPARα and PPARγ．

Key words：Osthole；monocrotaline；RVHI；right ven-tricle remodeling；PPARα；PPARγ

作者簡介：李葉麗（1991－），女，碩士，研究方向：心血管藥理學，E-mail：283398253＠qq．com；楊丹莉（1971－），女，博士，教授，碩士生導師，研究方向：心血管藥理學、抗炎免疫藥理學，通訊作者，Tel：0851-28642404，E-mail：393707603＠qq．com

基金項目：國家自然科學專項基金（No 81360498）；貴州省教育廳項目（No黔省專合字（2012）93號）

收稿日期：2015－05－18，修回日期：2015－06－15

文獻標志碼：A

文章編號：1001－1978（2015）09－1270－04

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．018