PCSK9及IDOL在姜黃素促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C中的作用

歐 露，張彩平，劉 英，喬新惠，麻燕妮，歐 淳，胡小波，田 英，龍石銀

（1．南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南衡陽 421001；2．常德市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南常德 415000）

PCSK9及IDOL在姜黃素促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C中的作用

歐 露1，張彩平1，劉 英2，喬新惠1，麻燕妮1，歐 淳1，胡小波1，田 英1，龍石銀1

（1．南華大學(xué)生物化學(xué)與分子生物學(xué)教研室，湖南衡陽 421001；2．常德市職業(yè)技術(shù)學(xué)院醫(yī)學(xué)系，湖南常德 415000）

中國圖書分類號(hào)：R282．71；R329．24；R344．81；R972．6；R977.3；R977.6

摘要：目的 從分子水平探討姜黃素的降脂機(jī)制，為姜黃素作為降脂藥物的臨床開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。方法 本研究運(yùn)用油紅O染色、酶法測(cè)定細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量，熒光染色檢測(cè)細(xì)胞膽固醇攝取，RT-Q-PCR及Western blot檢測(cè)姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇代謝相關(guān)因子在RNA和蛋白水平的表達(dá)。結(jié)果 姜黃素組的HepG2細(xì)胞內(nèi)紅色脂滴明顯增多，且TC及FC含量增高。DiI標(biāo)記LDL，姜黃素組HepG2細(xì)胞橙紅色熒光高于對(duì)照組。姜黃素能升高SREBP2和LDLR的mRNA和蛋白水平的表達(dá)；降低PCSK9蛋白成熟體及IDOL蛋白表達(dá)。結(jié)論 姜黃素可能通過下調(diào)PCSK9及IDOL的表達(dá)，進(jìn)而減少LDLR降解，促進(jìn)HepG2細(xì)胞攝取LDL-C。

關(guān)鍵詞：姜黃素；低密度脂蛋白受體；前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9型；誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體降解蛋白；固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2；3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶

網(wǎng)絡(luò)出版時(shí)間：2015－8－10 14：37 網(wǎng)絡(luò)出版地址：http：／／www．cnki．net／kcms／detail／34．1086．R．20150810．1437．021．html

血漿LDL-C水平增高是冠心病（coronary heart disease，CHD）最重要的危險(xiǎn)因素，降低LDL-C水平是防治心血管疾病的首選策略［1］。血漿中絕大部分LDL-C主要經(jīng)LDLR途徑代謝，LDLR數(shù)量、結(jié)構(gòu)及功能異常等引起的高膽固醇血癥增加了AS-CVD患病風(fēng)險(xiǎn)［2］。LDLR的表達(dá)同時(shí)受到轉(zhuǎn)錄水平及翻譯后水平兩方面的共同調(diào)節(jié)，轉(zhuǎn)錄水平主要受固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合蛋白2（sterol regulatory element binding protein 2，SREBP2）的調(diào)節(jié)，誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體降解蛋白（inducible degrader of low-densi-tylipoprotein receptor，IDOL）及前蛋白轉(zhuǎn)化酶枯草桿菌蛋白酶9型（proprotein convertase subtilisin／kexin type 9，PCSK9）則對(duì)LDLR進(jìn)行翻譯后水平的調(diào)節(jié)。IDOL具有E3泛素連接酶的作用，通過介導(dǎo)LDLR泛素化經(jīng)溶酶體途徑降解［3］，影響細(xì)胞表面LDLR的分布。他汀類藥物作為3-羥基-3-甲基-戊二酰輔酶A還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑［4］，可通過升高LDLR表達(dá)，降低血漿LDL-C水平，但同時(shí)卻升高了具有降低LDLR功能的PCSK9的表達(dá)，導(dǎo)致他汀類降脂作用受限［5］。為此，尋求具有降低IDOL及PCSK9表達(dá)，升高細(xì)胞表面LDLR水平的聯(lián)合用降脂新藥，仍是當(dāng)前ASCVD防治的研究焦點(diǎn)。

姜黃素（curcumin）屬二酮類化合物，是從姜科、天南星科植物的根莖中提取的植物多酚［6］。研究表明姜黃素可明顯升高HepG2細(xì)胞LDLR的mRNA及蛋白水平，通過激活SREBP2并使得其靶基因LDLR表達(dá)水平增高［7］，起到降脂的作用。然而，Tai等［8］則認(rèn)為是通過肝細(xì)胞核因子1α（hepa-tocyte nuclear factor 1α，HNF-1α）抑制轉(zhuǎn)錄水平PCSK9的表達(dá)，降低LDLR從溶酶體途徑降解，進(jìn)而使HepG2細(xì)胞表面LDLR水平升高。因此，為進(jìn)一步研究姜黃素的降脂機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)以HepG2為對(duì)象，探討姜黃素對(duì)LDLR的轉(zhuǎn)錄及翻譯后水平調(diào)節(jié)，為姜黃素作為降脂藥物的臨床開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1　材料

HepG2細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞生物學(xué)研究所細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基和無支原體胎牛血清（FBS）購于美國Gibco公司；姜黃素和25-羥膽固醇（25-HC）購自美國Sigma公司；人源性LDL購自廣州弈源公司；人源性LPDS購自美國Biomedical Technol-ogies Inc．公司；油紅O和DMSO購自美國Amresco公司；組織總膽固醇／游離膽固醇酶法測(cè)定試劑盒（E1015／E1016）購自北京普利萊基因技術(shù)公司；總RNA提取試劑盒（TRIzo1 Reagent）購自康為世紀(jì)生物科技有限公司；DiI-LDL購自Invitrogen公司；兔抗人的LDLR、IDOL和PCSK9抗體購自Abcam公司，山羊抗人的SREBP2抗體購自R＆D公司，辣根過氧化物酶（horseradishperioxidase，HRP）標(biāo)記的二抗：山羊抗兔和兔抗山羊均購自上海優(yōu)維寧生物科技公司。其余均為進(jìn)口或國產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

2　方法

2．1實(shí)驗(yàn)分組 油紅O染色及膽固醇含量酶法測(cè)定分組：①Basal，②Control（25 mg·L－1LDL），③

curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol·L－1curcu-min），④Vehicle（25 mg·L－1LDL＋體積分?jǐn)?shù)為0.000 625的DMSO）。

DiI-LDL、RT-Q-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)分組：①Basal，②Control（25 mg·L－1LDL），③LPDS（體積分?jǐn)?shù)為0．1的LPDS），④25-HC（10 mg·L－125-HC），⑤curcumin（25 mg·L－1LDL＋25 μmol· L－1curcumin）。

HepG2細(xì)胞接種于用含有體積分?jǐn)?shù)為0．1的FBS和體積分?jǐn)?shù)為0．01的青－鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)液，在37℃條件下培養(yǎng)24 h后，再按上述分組藥物孵育24 h。

2．2油紅O染色觀察胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，每孔105個(gè)細(xì)胞接種至預(yù)先放置好無菌蓋玻片的6孔板內(nèi)，培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h后，質(zhì)量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛固定30 min，油紅O染色7 min，蘇木精染色4 s，甘油封片，倒置顯微鏡拍照觀察，HepG2細(xì)胞中脂滴呈橘紅色，核呈藍(lán)色。

2．3酶法檢測(cè)細(xì)胞內(nèi)膽固醇 細(xì)胞培養(yǎng)至對(duì)數(shù)生長期，每孔105個(gè)細(xì)胞接種細(xì)胞至6孔板培養(yǎng)24 h，再藥物孵育24 h，PBS洗3次，吸干余液，加入200 μL裂解液，冰上裂解10 min，收集裂解液，6 000 r· min－1離心5 min，取上清液，按照總膽固醇含量酶法測(cè)定試劑盒（E1015／E1016）的說明書操作，37℃條件下水浴20 min后，酶標(biāo)儀分別測(cè)定總膽固醇和游離膽固醇的含量。BCA測(cè)各組細(xì)胞內(nèi)總蛋白含量用于標(biāo)化各樣本的膽固醇值，標(biāo)化后膽固醇的濃度單位為：總膽固醇（游離膽固醇）／蛋白＝μmol·g－1。

2．4DiI-LDL攝取檢測(cè) 對(duì)數(shù)期生長HepG2細(xì)胞以每孔105個(gè)細(xì)胞接種6孔板內(nèi)，貼壁生長24 h后，藥物孵育24 h。除Basal組外，其余各組更換培養(yǎng)液為體積分?jǐn)?shù)為0.02的LPDS＋DMEM，加DiI-LDL 10 mg·L－1，避光37℃孵育4 h，含質(zhì)量濃度為4 g ·L－1的BSA的PBS搖床搖洗2×5 min，PBS洗3次，質(zhì)量濃度為40 g·L－1的多聚甲醛的PBS固定10 min，PBS洗3次，Hoechst 33342染色20 min，PBS 洗3次，加抗熒光淬滅液，熒光顯微鏡觀察，細(xì)胞膜呈橙紅色熒光，細(xì)胞核呈藍(lán)色熒光。

2．5RT-Q-PCR測(cè)mRNA水平 對(duì)數(shù)期生長HepG2細(xì)胞以每孔106個(gè)細(xì)胞接種至50 mL培養(yǎng)瓶，培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h后，根據(jù)TRIzo1 Rea-gent說明書提取總RNA，紫外分光光度儀測(cè)定OD260／OD280比值介于1.9－2.1。瓊脂糖凝膠電泳分析RNA完整性，28s rRNA、18S rRNA條帶清晰可見，RNA未被降解，提取的總RNA可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。根據(jù)逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書操作，取2 μg總RNA逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)條件為：42℃、30 min，85℃、10 min；再取2 μg逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行real time-PCR，反應(yīng)體系為20 μL，引物由上海諾倫生物醫(yī)藥技術(shù)有限公司設(shè)計(jì)與合成（Tab 1）。PCR反應(yīng)條件：50℃、2 min，95℃、3 min，然后95℃、12 s，62℃、40 s，40個(gè)循環(huán)。用ΔΔCT來計(jì)算基因的表達(dá)水平，計(jì)算公式如下：ΔCT＝目的基因CT值－β-ac-tin基因CT值；ΔΔCT＝實(shí)驗(yàn)組ΔCT－對(duì)照組ΔCT；實(shí)驗(yàn)組／對(duì)照組基因表達(dá)水平的倍數(shù)＝2－ΔΔCT。

2．6Western blot檢測(cè)蛋白表達(dá)水平 細(xì)胞接種培養(yǎng)24 h，藥物孵育24 h后，冰上裂解30 min，收集細(xì)胞裂解液4℃條件下，13 000 r·min－1離心15 min。小心吸取上清，每組預(yù)留5 μL裂解液用

于BCA蛋白定量。裂解上清：SDS-loading buffer＝4∶1混勻，100℃條件下煮沸5 min，于－20℃保存。電泳條件先恒壓80 V，30 min，后轉(zhuǎn)換為120 V，50 min；電泳完畢后切膠，0.22 μm PVDF膜甲醛活化5 min，恒流300 mA，3 h濕轉(zhuǎn)轉(zhuǎn)膜；質(zhì)量濃度為50 g ·L－1的脫脂牛奶封閉2 h；TBST稀釋一抗（SREBP2稀釋1∶500；β-actin、LDLR、PCSK9和I-DOL稀釋比例均為1∶1 000），4℃搖床過夜，TBST洗脫一抗3×5 min；孵育二抗（1∶5 000），室溫溫和搖晃45 min，TBST洗脫二抗4×10 min；Tanon ECL高敏成像系統(tǒng)對(duì)結(jié)果進(jìn)行檢測(cè)。各組細(xì)胞目的蛋白與內(nèi)參β-actin的光密度比值，分別代表各目的蛋白表達(dá)水平。

Tab 1 Primer sequence

2．7統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 數(shù)據(jù)均采用SPSS 13．0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)值以±s表示，兩組間的比較用單因素方差分析。

3　結(jié)果

3．1油紅O染色觀察姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積的影響 為研究姜黃素處理24 h后對(duì)HepG2細(xì)胞荷脂情況的影響，油紅O染色結(jié)果顯示：Control組中細(xì)胞內(nèi)脂滴較Basal組增多；與Control相比，Vehi-cle組細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴無明顯變化，經(jīng)curcumin處理的細(xì)胞內(nèi)紅染脂滴明顯增加，表明curcumin促進(jìn)HepG2細(xì)胞脂滴蓄積增多（Fig 1）。

Fig 1 Curcumin accelerates LDL uptake stained by Oil-red O（×40）

3．2酶法測(cè)定HepG2細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量變化 為研究姜黃素處理后細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量的變化，通過膽固醇酶法測(cè)定結(jié)果顯示：與Basal組相比，Control細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平增高，提示細(xì)胞荷脂成功；與Control相比，Vehicle組細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平有增高的趨勢(shì)，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示溶媒對(duì)細(xì)胞攝取膽固醇無明顯影響；curcumin組細(xì)胞內(nèi)TC、FC水平明顯增高（P＜0.01），提示curcumin促使HepG2細(xì)胞攝取膽固醇使得胞內(nèi)TC、FC含量明顯增高（Fig 2）。

Fig 2 Effect of curcumin on total cholesterol and free cholesterol in HepG2

3．3熒光染色檢測(cè)HepG2細(xì)胞膽固醇攝取的影響為研究HepG2細(xì)胞是否通過促進(jìn)LDL攝取使膽固醇含量增高，DiI-LDL攝取實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與Con-trol組比較，LPDS組HepG2細(xì)胞橙紅色熒光明顯增高，而25-HC組紅色熒光則明顯降低；curcumin組HepG2細(xì)胞橙紅色熒光高于Control組，表明curcu-min促進(jìn)HepG2細(xì)胞LDL攝取（Fig 3）。

3．4姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞LDLR及SREBP2表達(dá)的影響 與Control相比，LPDS組和curcumin組LDLR和SREBP2的mRNA及蛋白表達(dá)水平明顯升高（P＜0.05）；25-HC組LDLR和SREBP2的mR-NA及蛋白的表達(dá)減少（P＜0.05）；curcumin組的LDLR和SREBP2的mRNA水平明顯升高（P＜0.05）。結(jié)果提示，curcumin可能通過激活SREBP2促進(jìn)LDLR表達(dá)增高（Fig 4）。

3．5姜黃素對(duì)HepG2細(xì)胞PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)的影響 Western blot結(jié)果顯示，與Control組相比，LPDS組中PCSK9蛋白明顯升高（P＜0.05），而誘導(dǎo)低密度脂蛋白受體降解蛋白（inducible de-grader of low-densitylipoprotein receptor，IDOL）蛋白

表達(dá)無差異；25-HC組中PCSK9蛋白水平明顯降低（P＜0.05），IDOL蛋白表達(dá)水平升高（P＜0.05）；curcumin組中PCSK9和IDOL蛋白水平明顯降低（P＜0.05）。結(jié)果提示：curcumin可能通過降低了PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)，減少了LDLR的降解，促進(jìn)血漿LDL-C的清除（Fig 5）。

Fig 3 DiI-LDL uptake by HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours（×20）

4　討論

Fig 4 Expression of LDLR and SREBP2 mRNA and protein｜treated with curcumin in HepG2 cells

美國心臟協(xié)會(huì)指出降低心血管事件主要?dú)w因于LDL-C的下降，他汀類藥物通過競(jìng)爭(zhēng)性抑制膽固醇合成限速酶的活性成為臨床降LDL-C的首選藥物，中等強(qiáng)度劑量他汀可降低血漿LDL-C 30%－40%的水平，不僅降低心血管事件，而且還降低了總死亡率，奠定了他汀在防控ASCVD事件中的核心地位［9－10］。然而他汀類還通過激活SREBP2使具有誘導(dǎo)LDLR經(jīng)溶酶體降解的PCSK9表達(dá)增高［11］，加倍他汀用藥劑量?jī)H進(jìn)一步降低LDL-C的6%，且不良反應(yīng)增加，致使他汀大劑量單用降脂作用受限。盡管AMG145（PCSK9單克隆抗體）已順利通過臨床Ⅲ期實(shí)驗(yàn)階段［12］，具有明顯降低血漿LDL-C水平，減少ASCVD風(fēng)險(xiǎn)的療效，然而因其免疫原性及臨床使用方式有限均使AMG145作為生物制劑降脂

藥物開發(fā)存在一定的局限性。

Fig 5 Levels of PCSK9 and IDOL protein expression in HepG2 cells treated with curcumin for 24 hours

本實(shí)驗(yàn)采用curcumin作用于體外培養(yǎng)HepG2細(xì)胞24 h，油紅O染色及膽固醇酶法測(cè)定結(jié)果表明，curcumin使HepG2細(xì)胞膽固醇蓄積增多；并通過DiI-LDL攝取實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步表明curcumin促進(jìn)HepG2細(xì)胞膽固醇攝取；LPDS是通過激活SREBP2促進(jìn)LDLR mRNA及蛋白表達(dá)增高，作為陽性對(duì)照組；而25-HC是通過阻斷SREBP2的激活，使LDLR mRNA及蛋白表達(dá)降低，作為陽性對(duì)照組，curcumin處理組SREBP2及LDLR mRNA及蛋白表達(dá)增高，因LDLR是SREBP2下游靶基因，結(jié)果提示curcu-min可能通過激活SREBP2轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)LDLR的表達(dá)增高，這一結(jié)果與Dou等［13］報(bào)道的一致。

LDLR途徑擔(dān)負(fù)著絕大部分血漿LDL-C的清除，LDLR的功能或表達(dá)異常產(chǎn)生高膽固醇血癥，增加了ASCVD患病風(fēng)險(xiǎn)［14］。LDLR除了受SREBP2轉(zhuǎn)錄水平調(diào)節(jié)之外，還受PCSK9及IDOL翻譯后水平的調(diào)節(jié)，影響著血漿LDL-C的代謝。通過GWAS （genome-wide association studies，GWAS）結(jié)果表明，墨西哥人群中IDOL的rs9370867因N342S與高膽固醇血脂高度正相關(guān)，而荷蘭人群中IDOL的R266X突變體引起明顯降低血脂的效應(yīng)［15］，提示IDOL多態(tài)性或突變影響人類血漿LDL-C的清除。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，curcumin作用后，PCSK9及IDOL蛋白表達(dá)降低，表明curcumin可能通過翻譯后水平抑制LDLR經(jīng)溶酶體途徑降解。curcumin還可通過抑制HNF-1α的活性降低PCSK9蛋白表達(dá)，減少LDLR溶酶體降解，促進(jìn)HepG2細(xì)胞膽固醇攝取［11］。但還需進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證明，curcumin是否通過過多靶點(diǎn)抑制HNF-1α的轉(zhuǎn)錄活性，阻滯IDOL泛素化溶酶體降解LDLR，使LDLR蛋白表達(dá)增高，這將是本文后續(xù)研究闡述的重要目標(biāo)。

（致謝：本文實(shí)驗(yàn)主要在生物技術(shù)系的分子生物實(shí)驗(yàn)室、蛋白化學(xué)實(shí)驗(yàn)室、細(xì)胞培養(yǎng)室、技能實(shí)驗(yàn)室及生物信息室等實(shí)驗(yàn)室完成，謝謝本校省部級(jí)重點(diǎn)心血管病研究所、腫瘤研究所、病原微生物研究所對(duì)本實(shí)驗(yàn)無償提供流式細(xì)胞儀、激光共聚焦顯微鏡等必要設(shè)備服務(wù)。）

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Role of PCSK9 and IDOL in curcumin accelerating LDL-C uptake in HepG2 cells

OU Lu1，ZHANG Cai-ping1，LIU Ying2，QIAO Xin-hui1，MA Yan-ni1，OU Chun1，HU Xiao-bo1，TIAN Yin1，LONG Shi-yin1
（1．Dept of Biotechnology，University of South China，Hengyang Hunan 421001，China；2．Dept of Medicine，Changde Vocational Technical College，Changde Hunan 415000，China）

Abstract：Aim To explore the lipid-lowering mecha-nisms of curcumin from the molecular levels and pro-vide scientific basis for clinical development of lipid-lowering drugs．Methods Using oil red O staining and enzymic to determinate the levels of cholesterol in HepG2 cells．Moreover，uptaking of DiI-LDL was also measured．The expressions of mRNA and protein were detected by RT-Q-PCR and Western blot．Results

The red lipid droplets and the levels of TC and FC sig-nificantly increased in HepG2 cells after treated with curcumin．The orange red fluorescence was higher than that of control．Curcumin could promote the expression levels of mRNA and protein of SREBP2 and LDLR，what′s more，curcumin could reduce the expression of the mature PCSK9 level and IDOL protein．Conclu-sion Curcumin accelerates LDL-C uptake probably via downregulating the expression of PCSK9 and IDOL in HepG2 cells．

Key words：curcumin；low density lipoprotein choles-terol receptor；proprotein convertase subtilisin／kexin type 9；inducible degrader of low-densitylipoprotein re-ceptor；sterol regulatory element binding protein 2；ac-tivation of 3-hydroxy-3-methylglutaryl coenzyme A re-ductase

作者簡(jiǎn)介：歐 露（1989－），女，碩士生，研究方向：脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化，E-mail：2985800843＠qq．com；龍石銀（1973－），女，博士，教授，研究方向：脂蛋白與動(dòng)脈粥樣硬化，通訊作者，E-mail：longshiyin＠126．com

基金項(xiàng)目：湖南省科技廳項(xiàng)目（No 2015SK2038）；湖南省衛(wèi)生計(jì)生委項(xiàng)目（No B2015-49）；湖南省高層次衛(wèi)生人才“225”工程項(xiàng)目基金；湖南省自然科學(xué)基金（No 2014JJ3104）；南華大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（No 2013XCX20）；南華大學(xué)“十二五”科技創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)基金，南華大學(xué)留學(xué)回國人員啟動(dòng)基金（No 2013XQD52）；湖南省大學(xué)生研究性學(xué)習(xí)和創(chuàng)新性實(shí)驗(yàn)計(jì)劃項(xiàng)目資助（No 2015-230）

收稿日期：2015－05－11，修回日期：2015－06－15

文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

文章編號(hào)：1001－1978（2015）09－1286－06

doi：10．3969／j．issn．1001－1978．2015．09．021