槲皮素對K562細胞增殖和凋亡的影響

潘莉萍 袁偉

（武漢大學基礎醫學院，湖北武漢430072）

慢性骨髓性白血病（CML）發病率高，預后差，死亡率高，尋找新的治療方案是各國學者關注的重點［1］。槲皮素是一種常見類黃酮物質，最近研究發現其具有廣泛的生物活性如抗炎、抗氧化、抗腫瘤等［2－4］。本研究以人慢性髓系白血病細胞K562為靶細胞，探討槲皮素對慢性髓系白血病細胞K562的作用及其作用機制。

1 材料與方法

1.1 藥品與試劑 K562（購自武漢病毒研究所）槲皮素（sigma，美國），RPMI 1640培養基（Gibgo，美國）；小牛血清（杭州四季青公司）；12孔培養板（Falcon，美國）；β－actin抗體（Abmart，中國），p－JAK2抗體（CST，美國），JAK2抗體（CST，美國）p－STAT3抗體（CST，美國），STAT3抗體（CST，美國）。TRIzol reagent（Invitrogen，美國），逆轉錄試劑盒（GeneCopoeia，美國），SYBRgreen（Takara，日本），Q－PCR儀（BIO－RAD，美國），蛋白裂解液RIPA（碧云天，中國），蛋白酶抑制劑cocktail及Western blot凝膠制備試劑盒購自武漢谷歌生物公司，BCA蛋白定量試劑盒（上海碧天生物技術有限公司），qPCR引物（北京擎科生物技術有限公司），酶標儀（Thermo Fisher，美國）。

1.2 實驗方法 （1）細胞培養：K562細胞置于含有10%胎牛血清的RPMI 1640培養液中，加入青霉素（100U／mL）和鏈霉素（100U／mL），在37℃、5% CO2飽和濕度培養箱中培養。（2）K562細胞增殖的MTT法檢測：取對數生長期K562細胞，接種于12孔板內，調整密度為2×105／mL，每孔90μL，分別加入槲皮素（0，10，20μmoL），另設空白孔組（只加培養基，不加藥物），每組設3個復孔。12孔板置于37℃、5%CO2培養48h，每孔加入5mg／mL的MTT溶液20μL，繼續培養4h，然后加入三聯裂解液［10%SDS＋5%異丁醇＋1%HCL（10mol／L）］，100μL，37℃放置過夜后，用酶標儀于波長570nm處讀取吸光度（OD）值，根據OD值計算細胞增殖抑制率：增殖抑制率＝（1－實驗組OD值／空白組OD值）×100%。（3）Annexin－V／PI雙染法檢測細胞凋亡：取對數生長期的K562細胞以1×105／mL接種于96孔板內。細胞培養48h后，加入槲皮素（0，10，20）μg／mL，取1mL細胞懸液，1 000r／min離心5min，棄培養基，加RNA酶，37℃水浴1h，放入冰浴加入0.5mg／L碘化丙啶（PI）及Annexin V，流式細胞儀檢測CELIQU－，EST軟件分析細胞凋亡率。（4）Western blotting檢測槲皮素對K562細胞JAK2、STAT 3，p－JAK2，p－STAT 3，Bax和Bcl－2表達：按照蛋白裂解液RIPA操作說明提取各組蛋白，BCA法進行蛋白定量。取各組細胞總蛋白樣品40μg，以β－actin為內參，經SDS－PAGE凝膠電泳、轉膜，然后用含5%脫脂奶粉的PBS封閉2h，分別加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋JAK2抗體（1∶1 000）、p－JAK2（1∶500）、STAT 3（1∶1 000）、p－STAT 3（1∶500）、Bax（1∶500）、Bcl－2（1∶1 000）、β－actin（1∶3 000）抗體，4℃孵育過夜。PBS洗膜3次，10min／次，根據一抗的來源，再分別加入含2%脫脂奶粉的PBS稀釋的HRP，標記羊抗兔IgG（1∶500），HRP標記羊抗鼠IgG（1∶5 000），室溫下作用2h，PBS洗膜3次，10min／次，ECL化學發光顯色、壓片、顯影、定影、膠片掃描保存。用Ge－l Pro Analy zer（Ver.3.0）軟件測定蛋白條帶灰度值，JAK2、p－JAK2、STAT 3、p－STAT 3條帶灰度值與β－actin內參條帶灰度值的比值分別將上述蛋白表達量化。（5）實時定量PCR（RT－PCR）檢測Bax和Bcl－2：按照總RNA提取試劑盒（takara）說明提取各組細胞總RNA，紫外分光光度計測量濃度（thermo fisher），逆轉錄以及擴增反應按試劑盒說明書（takara）進行，，實時定量PCR（Bio－Rad）。引物均由invitrogen公司合成。管家基因β－actin作為內參對照基因，用得到的各樣本的Ct值按公式2－ΔΔCT計算相對表達量。引物序列，見表1。

表1 實時定量PCR檢測的引物序列

1.3 統計學方法 采用SPSS 12.0統計軟件包進行分析，實驗結果采用mean±S.D表示，資料采用單因素方差分析（ANOVA），多個樣本之間的兩兩比較采用t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 槲皮素抑制K562細胞增殖 MTT檢測實驗結果顯示，抑制K562細胞增殖（P＜0.05）作用呈濃度依賴性，最佳抑制濃度為20μmol／L。見圖1。

圖1 MTT檢測槲皮素對K562細胞增殖的影響

2.2 槲皮素誘導K562細胞凋亡 實驗結果顯示，槲皮素誘導K562細胞凋亡作用呈濃度依賴性，最佳濃度為20μmol／L，P＜0.05見圖2。

圖2 槲皮素對各組K562細胞凋亡的影響（＊P＜0.05）

2.3 槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2mRNA表達的影響 實驗結果顯示槲皮素呈濃度依賴性促進Bax mRNA表達增加（＊P＜0.05）而降低Bcl－2mRNA表達（＊P＜0.05）。見圖3。

圖3 RT－PCR檢測槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2mRNA表達的影響（＊P＜0.05）

2.4 槲皮素對K562細胞JAK2、STAT3蛋白表達的影響 實驗結果顯示：經槲皮素作用K562細胞48h后，JAK2、STAT3蛋白濃度無明顯變化（P＞ 0.05），p－JAK2、p－STAT3濃度明顯降低（△P＜0.05），見圖4。

圖4 Western blotting檢測槲皮素對K562細胞JAK2、STAT3蛋白表達的影響

2.5 槲皮素對K562細胞Bax、Bcl－2蛋白表達的影響 實驗結果顯示，經槲皮素作用K562細胞48h后，Bax表達明顯增高（△P＜0.05），而Bcl－2表達明顯降低（1P＜0.05）。見圖5。

圖5 Western blotting檢測槲皮素對K562細胞BCL－2、Bax蛋白表達的影響（1 P＜0.05）

3 討 論

目前對CML大多仍采用傳統的化療和干細胞移植，但化療對肝臟和腎臟很大損害，且復發率高［1］。而干細胞移植受制于干細胞的緊缺和現有條件，難以大規模開展。祖國醫學博大精深，因此從祖國醫學寶庫中挖掘抑制白血病細胞惡性增殖的方法是研發高效低毒的抗肺癌藥物的有效途徑之一［1］。槲皮素是一種廣泛存在于植物的花、葉、果實中的一種多羥基黃酮類化合物，化學名為3，3’，4’，5，7－五羥基黃酮，具有多種生物學活性，如抗炎、抗凋亡、抗氧化應激以及抗腫瘤的活性，因此具有很高的藥用價值［5］。最近研究發現槲皮素具有明顯的抗腫瘤活性作用，可抑制肝癌、乳腺癌和胃癌等［2－6］。而槲皮素對血液系統腫瘤之一的CML的作用及其機制尚不清楚。

實驗中我們通過MTT和流式檢測發現槲皮素可以呈濃度依賴性誘導白血病細胞K562增殖抑制和促進K562細胞凋亡，以及促進凋亡蛋白Bax明顯增高，抗凋亡蛋白Bcl－2明顯降低，上調Bax／Bcl－2比例。因此我們推測槲皮素具有抑制K562細胞增殖和促進K562凋亡的作用而具有抗白血病腫瘤的活性，但具體機制不明。

JAK2／STAT3信號途徑是在多種細胞發揮介導作用的信號通路，具有調節炎癥、凋亡、增殖等功效的。目前研究發現JAK2／STAT3信號通路在K562細胞增殖扮演重要作用［7］。實驗結果顯示槲皮素可以呈濃度依賴性降低p－JAK2和p－STAT3的表達，而對JAK2和STAT3表達無明顯影響，因此我們推測槲皮素是通過降低JAK2和STAT3信號蛋白磷酸化結構修飾，而非調節JAK2和STAT3的表達量而抑制JAK2／STAT3信號通路的激活。

綜上所述，我們推測槲皮素可通過抑制JAK2／STAT3信號通路激活而抑制K562細胞增殖和促進K562凋亡。但槲皮素是直接作用于JAK2信號分子還是通過調節其上游激酶和信號分子而間接發揮作用仍不清楚，尚需進行更深入的研究。

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