腎衰合劑通過PKA信號通路抑制腎纖維化的實驗觀察*

鄒 榮，肖方喜，熊 飛，陳 芳，胡韜韜，黃曉麗，陳 菁，梁鴻卿

武漢市第一醫院，湖北 武漢 430022

慢性腎衰竭是各種慢性腎臟疾病發展的最終階段，腎小球硬化和腎間質纖維化是多種腎臟疾病發展至終末期腎衰竭的共同通路。轉化生長因子β1(TGFβ1)過度表達在腎間質纖維化過程中起到關鍵調控作用。經典的TGFβ/Smad通路已經在各種纖維化進程中得到廣泛論述。但TGFβ也是一個作用廣泛的細胞因子，除了激活TGFβ/smad通路，還能夠活化其他重要的信號轉導通路，如ERK、p38MAPK和PKA信號通路。抑制TGFβ1誘導PKA/CREB信號轉導能有效抑制胞外基質蛋白表達［1-2］。腎衰合劑是名中醫管竟環教授經過長期臨床實踐總結的經驗方。針對腎衰合劑的臨床觀察和動物實驗證實腎衰合劑能有效緩解慢性腎衰竭的進展［3-5］。但腎衰合劑治療慢性腎衰竭的分子機制仍不清楚。因此，我們擬建立慢性腎衰竭大鼠模型，觀察腎衰合劑對PKA信號通路和腎臟損害的影響，以探討腎衰合劑治療慢性腎衰竭的分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物分組和處理 30只健康雄性SD大鼠［購于華中科技大學同濟醫學院動物中心，許可證號scxk(鄂)2011-0007］，體質量180～200 g，隨機分為假手術組、動物模型組、中藥干預組；5/6腎臟切除建立慢性腎臟病模型。2%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)腹腔注射麻醉大鼠，俯臥固定，背部備皮、消毒，沿左肋脊角處切開皮膚，逐層暴露左側腎臟，剝除腎包膜，結扎上下極分別切除腎臟的1/3，1周后，沿右肋脊角處切開皮膚，完全摘除右側腎臟。假手術組僅行麻醉暴露雙腎，剝除腎包膜，不做手術切除。在手術1周后每天給予腎衰合劑［6］3 mL灌胃；手術后12周處死大鼠，生理鹽水將腎臟灌洗至發白，迅速摘取腎臟，部分殘腎固定于4%多聚甲醛以便制備石蠟切片，其余-80℃冰箱凍存，用于制備組織勻漿。

1.2 生化檢測 每周測血壓，采用自動生化分析儀檢測血肌酐(Scr)、尿素氮(Bun)、尿白蛋白(Alb)、尿蛋白/尿肌酐比值(UP/Ucr)等指標。第12周時采用內眥靜脈取血法采取靜脈血1 mL，代謝籠留取大鼠24小時尿液。采用BECKMAN自動生化儀測定Scr、Bun水平。BCA方法測定24小時尿蛋白含量。

1.3 腎臟病理學檢查 腎臟組織應用4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切片3μm厚。腎組織常規處理后行HE染色，光鏡下觀察腎臟損害程度。依Rai j法對腎小球硬化程度進行半定量分級，計算腎小球硬化面積指數(GSI)和腎小管間質損傷評分(TIS)。

1.4 Western Blot檢測 col lagenⅣ、α平滑肌肌動蛋白(αSMA)、CREB、pCREB蛋白表達：稱取 100 mg新鮮冰凍組織加入1 mL蛋白裂解液(南京碧云天生物技術研究所)進行勻漿，4℃12 000 r/min離心30分鐘，提取上清液。BCA法測定蛋白濃度。待測樣品按100μg/孔上樣，行10%SDS-PAGE電泳，轉膜。5%脫脂奶粉37℃封閉1小時，小鼠抗大鼠α-SMA單克隆抗體(santacruz)、兔抗大鼠col lagenⅣ單克隆抗體(santa cruz)、兔抗大鼠CREB、pCREB單克隆抗體(cel l signal ing)4℃孵育過夜，洗膜后用HRP標記兔抗小鼠IgG、羊抗兔IgG 37℃孵育1小時，ECL顯色成像。以β-actin為內參，應用圖像分析軟件對特異性條帶做吸光度(A)定量分析蛋白相對表達量。

1.5 Peptag非放射性蛋白激酶A檢測系統(promega)檢測PKA活化 取出冰凍大鼠腎皮質組織，用預冷的勻漿器在5mL預冷的PKA ext raction buf fer中勻漿1 g腎組織，4℃15 000 rpm離心15分鐘，取上清液。按promega試劑盒操作手冊步驟檢測PKA活性。

1.6 各組取腎組織 常規冰凍切片，冷丙酮固定，滴加FITC熒光標記抗大鼠IgG多抗(1∶50)，室溫孵育45分鐘后鏡檢并拍照。熒光強度表示：(-)無熒光；(±)高倍鏡下似乎可見；(+)低倍鏡下似乎可見，高倍鏡下明顯可見；(++)低倍鏡下明顯可見，高倍鏡下清晰可見；(+++)低倍鏡下清晰可見，高倍鏡下耀眼；(++++)低倍鏡下耀眼，高倍鏡下刺眼。

1.7 統計學分析 應用SPSS 19.0統計學軟件進行統計分析，計量資料以(χ±s)表示，采用t檢驗，以P＜0.05表示有統計學意義。

2 結果

2.1 CRF大鼠血生化指標 治療過程中假手術組死亡1只，模型組死亡3只，中藥干預組死亡2只，共死亡6只。與假手術組比較，模型對照組24小時尿白蛋白、血尿素氮和血肌酐均顯著升高(P＜0.05)；與模型對照組比較，中藥干預組24小時尿白蛋白、尿素氮和血肌酐均顯著降低(P＜0.05)。見表1。

表1 大鼠血清肌酐、尿素氮，24小時尿蛋白檢測結果

2.2 5/6腎切除大鼠腎小球硬化及腎間質纖維化 HE染色下，假手術組大鼠腎組織未見明顯病變，腎小球和腎小管大小、形態正常，結構清晰，間質未見明顯炎細胞浸潤。模型對照組腎皮質變薄，腎小球系膜細胞明顯增生，硬化增多，部分腎小管明顯萎縮、消失，部分腎小球發生代償性肥大，腎小管發生代償性擴張，部分可見蛋白管型，間質纖維組織增生，大量淋巴細胞浸潤。與模型對照組相比，中藥干預組病變程度明顯減輕，腎小球硬化減少，腎小管萎縮及間質纖維化程度減輕，炎細胞浸潤減少(見圖1)。

圖1 光鏡下各組大鼠腎臟組織形態(HE染色，×200)

表2 腎小球硬化指數和腎小管間質損傷

2.3 αSMA、col lagenⅣ膠原表達 與假手術組比較，模型對照組αSMA、col lagenⅣ蛋白水平均明顯升高(P＜0.05)；中藥干預組αSMA、col lagenⅣ蛋白水平明顯低于模型組(P＜0.05)。見圖2。免疫熒光檢測顯示模型組αSMA表達明顯增強，沉積于腎小球系膜區和少數毛細管袢，部分呈團塊狀，熒光強度多為 (+++～++++)，腎衰合劑能抑制αSMA的表達，呈顆粒樣散在分布，強度為(+～++)。見圖 2。

圖2 Western Blot檢測col lagenⅣ、αSMA表達

2.4 腎皮質PKA 與假手術組比較，模型組PKA被明顯激活，給予中藥干預后PKA活化狀態被明顯抑制，見圖3。

圖3 蛋白激酶A的檢測

2.5 皮質蛋白pCREB的表達 假手術組、模型對照組、中藥干預組均有CREB蛋白表達，表達量3組無明顯差異；與假手術組相比，模型組pCREB表達明顯增加，與PKA活化表現一致，差異有統計學意義(P＜0.05)；給予中藥干預后，pCREB表達量被明顯抑制，與模型組相比有統計學意義(P＜0.05)。見圖4。

3 討論

慢性腎臟病(CKD)是一種嚴重危害人類健康的泌尿系統疾病，腎間質纖維化是各種CKD發展到ESRD的共同途徑，其主要病理改變表現為腎間質成纖維細胞增生和胞外基質蛋白過度積聚，是多種細胞、生長因子、細胞因子共同參與、相互作用，最終導致胞外基質蛋白合成增多、降解減少，過度沉積的結果［7］。胞外基質蛋白是由細胞產生并分泌到細胞外周圍中的物質，主要包括纖維成分、連接蛋白和填充分子等。正常的情況下，ECM的生成和降解保持動態平衡。腎臟局部缺血、缺氧及炎癥細胞浸潤時，多種生長因子持續表達導致腎間質成纖維細胞增生和ECM的沉積［8］。

慢性腎衰竭為現代醫學病名，中醫學據其臨床演變過程將其分屬于關格、癃閉、水腫、虛勞等疾病范疇。本病的形成，存在虛、濁、瘀、毒四大病理機制，其中虛是主要病機,且以腎虛為主，兼及肝、脾、肺。隨著病情進展，由于陰損及陽或陽損及陰，以至出現氣陰兩虛及脾腎陽虛等證,在正虛的同時挾瘀濁毒等實邪，水濕內蘊體內，日久化濁，濁腐成毒，毒滯成瘀，濕、濁、毒、瘀相互交結，蘊結于內，出現三焦阻遏，陰陽乖亂，氣血耗傷等諸多病理變化,并形成惡性循環［9-10］。

腎衰合劑是我院全國知名老中醫管競環教授治療慢性腎衰竭的臨床經驗方，主要針對CRF正虛邪實病機的脾腎虛損，氣血不足而設，配以化濕祛瘀中藥。方藥組成以溫補脾腎、補益氣血藥為主，重在恢復中焦，使后天養先天，祛濁化瘀。方中黃芪、黨參健脾益氣；桑椹子、熟地黃滋補腎精以固腎元；白術、茯苓健脾化濕，以絕濁毒生化之源。諸藥合用共奏扶正祛邪，調和陰陽之功［6］。經過10余年療效觀察，臨床大樣本觀察證實腎衰合劑能夠改善慢性腎衰竭患者脾腎陽虛癥狀，有效降低慢性腎衰竭患者體內毒素水平，延緩腎功能惡化進程[3]；腎衰合劑聯合蟲草菌粉能減輕腎小管損傷，保護殘余腎功能［4］；腎衰合劑配合灌腸治療CRF能改善腎功能，改善血液流變學異常，降低血管內皮素ET-1水平［5］；動物實驗亦證實，中藥腎衰合劑可通過升高血PTH、降低降鈣素CT而糾正高鈣低磷狀態，達到治療慢性腎衰竭的目的［11］。

PKA是一類廣泛存在于真核細胞的蛋白激酶。經典PKA通路可以表示為AC/c AMP/PKA/CREB。其全酶(hol oenzyme)為非活化的狀態，其蛋白分子是由兩個調節亞基(R)和兩個催化亞基(C)構成的異四聚體。CRH與其I型受體結合后，通過G蛋白耦聯，激活腺苷酸環化酶，使細胞內環腺苷酸(c AMP)濃度增加，c AMP結合到PKA調節亞基，釋放出有活性的催化亞基。而有活性的催化亞基轉位進入核內，催化c AMP反應元件結合蛋白(CREB)的Ser l 33位點磷酸化以啟動下游基因表達，調控細胞各種生理、病理改變［12-13］。我們在前期腎小球硬化的機制研究中發現，PKA信號通路在TGFβ誘導的腎小球硬化進程中起到了重要的信號傳遞作用［14］。抑制PKA/CREB通路能直接阻斷TGFβ1誘導的腎小球硬化效應。在本研究發現，5/6腎切除大鼠呈現PKA異常活化狀態，給予腎衰合劑治療能明顯抑制大鼠腎皮質PKA的活性，抑制CREB磷酸化，阻止系膜細胞向成纖維細胞轉分化，減少胞外基質蛋白沉積，從而抑制腎小球硬化的發生發展。

本研究結果表明，腎衰合劑能改善慢性腎衰竭大鼠腎功能，降低 BUN、Scr，減少尿蛋白排泄。該腎臟保護效應可能通過抑制PKA/CERB信號通路級聯效應實現。這為臨床上應用中藥治療慢性腎衰竭提供了一定的實驗依據，但該方防治慢性腎衰竭的機制尚有待進一步深入研究。

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