封閉負壓引流對兔放射性潰瘍創面愈合的影響

龔震宇，馮小艷，熊銳華，詹 球，李小龍

封閉式負壓引流技術(vacuum-assisted closure，VAC)是近年來興起的一種促進創面愈合的新型治療方法，是通過將吸引裝置與傷口敷料連接后，使創面維持在負壓狀態下，起到促進創面愈合的作用。它是由Fleischmann首創的可控制全創面高負壓持續引流演變而來，目前被廣泛運用到各種急慢性創面的治療與促進創面愈合中［1］。放射性皮膚潰瘍(radiation ulcer)是常見的皮膚損害，臨床上主要是由腫瘤的放射性治療、意外放射照射事故引起。隨著腫瘤放射治療的廣泛開展，臨床上放射性潰瘍發生率逐年增加。一旦潰瘍形成，若不及時處理會造成潰瘍加深、出血、感染等危害，甚至危及患者的生命。放射性潰瘍的治療正越來越受到臨床醫生關注［2］。筆者采用兔放射性潰瘍模型，觀察了VAC對兔放射性潰瘍創面組織愈合的影響，旨在為探討VAC促進難愈性創面愈合的作用機制提供理論基礎，現報告如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 選擇16只清潔級新西蘭白兔作為研究對象，由解放軍第一八一醫院動物實驗中心提供，體質量2.0～2.5 kg，飼養時控制溫度在(22.6±2.3)℃，濕度在(60.5±5.0)%。按隨機數字表法分為2組，其中，對照組8只，雌3只，雄5只，平均體質量(2.2±0.2)kg;實驗組8只，雌4只，雄4只，平均體質量(2.3±0.3)kg。2組白兔均在相同環境下用相同份量的飼料飼養。

1.2 設備及試劑 武漢維斯第醫用科技股份有限公司提供的封閉負壓引流治療系統，通過電腦控制的壓力裝置產生持續負壓;北京醫研所生產的BJ-6B直線加速器;Promega公司生產的RT-PCR試劑盒擴增MMP-1、MMP-2、TIMP-1和TIMP-2;成纖維細胞生長因子(bFGF)和血管內皮生長因子(VEGF)試劑盒購自晶美生物工程(北京)有限公司。

1.3 兔放射性潰瘍模型制作及處理 每只兔均單籠喂養，后臀部剃毛，未使用硫化鈉脫毛。24 h后確認脫毛區無損傷后接受照射。照射前采用3%戊巴比妥鈉靜脈注射麻醉，劑量30 mg/kg。照射范圍為兔后臀部約直徑5cm圓形皮膚。1次照射劑量為35 Gy，造成深Ⅱ度創面模型。照射條件:BJ-6B直線加速器(北京醫研所)，6 MV高能X射線，源皮距100cm，準直器:直徑5cm。劑量率300 cGy/min。皮膚外加蓋1.3cm有機玻璃片，以使照射最大吸收劑量位于皮膚處。照射后各組兔均正常單籠喂養。照射后14 d創面出現后，按照分組，分別采用VAC治療及常規包扎，直至創面取材或創面愈合。

1.4 實驗觀察指標及方法

1.4.1 創面肉眼觀察及愈合時間 肉眼觀察創面腫脹及分泌物情況，觀察創面壞死組織清除及肉芽組織的生長情況;記錄創面愈合時間，愈合時間即創面完全上皮化所需的時間。

1.4.2 創面組織基質金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的測定 在實驗前、損傷后第3、第7和第14天均取潰瘍中央肉芽組織進行處理。MMP-1、MMP-2和 TIMP-1反應條件均為60℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，TIMP-2 反應條件為52℃下1 min，68℃下2 min和68℃下7 min，每項檢查均行30個循環，產物均于1.2%瓊脂糖上觀察電泳情況，經掃描系統測定密度值。

1.4.3 血清生長因子含量測定 在實驗前、損傷后第3、第7和第14天采用ELISA法檢測白兔血清bFGF和VEGF的含量，檢測過程嚴格按照試劑盒的要求進行。

2 結果

2.1 2組創面肉眼觀察及愈合時間比較 實驗組創面采用VAC處理后，肉眼觀察可見創面腫脹及分泌物與對照組比較明顯得到控制，創面壞死組織的清除與肉芽組織的生長也比對照組也明顯加快;實驗組創面平均愈合時間為(16.3±2.6)d，對照組創面平均愈合時間為(20.4±3.7)d，組間比較，差異具有統計學意義(t=2.357，P＜0.05)。

2.2 2組創面組織基質金屬蛋白酶與金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達比較 實驗前2組創面MMP-1和MMP-2 mRNA的表達比較，分別t=0.824和t=0.737，均P＞0.05，差異無統計學意義;而損傷后第3、第7和第14天創面 MMP-1和 MMP-2 mRNA的表達比較，均P＜0.05，差異具有統計學意義，實驗組均顯著低于對照組(表1);實驗前2組創面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達比較，分別t=0.688和t=0.596，均P＞0.05，差異無統計學意義;而損傷后第3、第7和第14天創面TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達比較，均P＜0.05，差異具有統計學意義，實驗組均顯著高于對照組(表2)。

表1 實驗組和對照組創面組織基質金屬蛋白酶mRNA的表達比較(±s)

表1 實驗組和對照組創面組織基質金屬蛋白酶mRNA的表達比較(±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動物數MMP-2實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天MMP-1對照組 8 83.4±12.3 66.3±10.2 54.7±9.2 36.5±7.5 79.4±10.9 62.7±9.8 49.6±8.9 34.2±6.8實驗組 8 84.6±12.9 51.6±9.5a 42.8±8.6a 29.7±6.4a 80.3±11.6 50.4±9.1a 39.7±8.2a 25.3±6.1a

2.3 2組血清細胞因子表達比較 實驗前2組血清bFGF和VEGF的表達比較，分別t=0.406和t=0.669，均P＞0.05，差異無統計學意義;而損傷后第3、第7和第14天血清bFGF和VEGF的表達比較，均P＜0.05，差異具有統計學意義，實驗組均顯著高于對照組(表3)。

3 討論

目前，皮膚放射性損傷臨床上主要由X線、γ射線及β射線一次大劑量或反復多次照射引起。損傷的程度因射線的劑量、種類不同而有差別，X線、γ射線均可引起電離輻射，而電離輻射能夠將能量傳遞給如蛋白質、DNA等生物大分子，導致分子結構與活性的改變，也可通過產生的自由基損傷生物分子［3］。皮膚表皮細胞及附屬器對各種射線均較為敏感，受到射線照射后會出現一系列的變化，引起皮膚破潰，并逐漸發展為放射性潰瘍。放射性潰瘍在顯微鏡下顯示具有較少的肉芽組織以及成纖維細胞，增生細胞的粗面內質網較少并發生破裂、擴張;線粒體可出現腫脹空化，微管微絲減少，各種細胞器明顯減少;周圍組織內浸潤的漿細胞發生變性，毛細血管內皮細胞因增生而導致血管腔狹窄;潰瘍底部及周圍纖維組織因膠原變性而出現玻璃樣變性，同時放射性潰瘍周圍成纖維細胞的數量及合成能量均下降。這些都導致了皮膚放射性潰瘍傷口收縮不良以及愈合延遲［4-5］。

VAC通過封閉的類似吸盤裝置以及相關管道做負壓吸引治療，負壓直接作用于潰瘍創面，增加了創面局部血流量，激活了創面細胞的活性。同時持續的負壓吸引作用于創面，還可及時吸出創面的滲液，防止因創面滲液積聚形成細菌培養基，且持續的負壓吸引增加了創傷處細胞的張力，起到了機械性牽引的作用，利于創面的愈合［6-7］。目前研究認為，VAC通過以下機制促進創面愈合［8-12］:(1)促進創面局部微循環和肉芽組織生長。創面長期不能愈合多是由于創面局部血供不佳，導致創面組織氧代謝不足。在缺氧的環境下，創面局部組織會出現代謝紊亂，抑制了局部組織細胞的增殖。VAC由于去除了局部組織過多的液體，緩解了局部水腫，對周圍組織小血管的壓迫得以解除;同時負壓下細小動脈會擴張，增加了細胞的有絲分裂，加強了創面周圍微血管的增生，有效降低了血管后負荷，潰瘍局部血流得以恢復，這又促進了創面的愈合;VAC還可促進肉芽組織形成。肉芽組織的形成可為上皮組織生長提供條件，利于創面愈合;(2)減輕局部組織水腫。局限性水腫既起到壓迫創面局部血管與淋巴系統，增加創面的皮膚張力的作用;還能夠起到加重創面局部微血管后負荷，減少皮瓣血液供應增加的作用，這些均對創面的愈合產生不良影響。VAC的負壓系統可有效去除創面滲出物與壞死組織，能夠有效減少周圍組織間壓力和組織間液體的積聚，因而降低了周圍血管的通透性，緩解了組織水腫;(3)促進創面細胞增殖及抑制凋亡。VAC可在創面形成一種機械應力，這種力在降低創面張力的同時也可通過細胞骨架與細胞膜傳導至細胞內，最終將信號傳導至細胞核。這促進了生長因子的合成與分泌，如PG、蛋白激酶C、磷酸肌醇和Ca2+等，這些生長因子通過作用誘導了成纖維細胞、表皮細胞、血管內皮細胞等組織細胞增生、蛋白產物合成及血管生成，促進了創面的愈合;(4)抑制細菌繁殖，清除壞死物質。潰瘍創面延遲愈合甚至不愈合往往與創面感染相關，同時細菌競爭性消耗了局部組織修復所需要的氧氣與營養，局部大量細菌繁殖也改變了創面微環境，這對正常組織細胞的生長起到了抑制作用，最終造成創面的不易愈合。VAC可令創面保持封閉狀態，對外來細菌及有害微生物有效隔離，避免了細菌的交叉感染;封閉所營造的低氧環境也對細胞增殖起到抑制作用，引流也促進了創面細菌、壞死物及滲出物的清除，破壞了利于細菌生長的環境，顯著降低了創面細菌感染率。

表2 實驗組與對照組創面組織金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達比較(±s)

表2 實驗組與對照組創面組織金屬蛋白酶組織抑制劑mRNA的表達比較(±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動物數TIMP-2實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天TIMP-1對照組 8 26.3±6.4 35.2±7.1 54.5±7.8 76.5±8.7 31.6±7.6 44.3±8.1 60.2±8.8 83.6±9.8實驗組 8 25.7±6.1 46.3±7.7a 63.6±8.3a 84.3±9.5a 30.3±7.3 56.2±8.8a 75.4±9.3a 96.4±10.7a

表3 實驗組與對照組血清細胞因子表達比較(ng/L，±s)

表3 實驗組與對照組血清細胞因子表達比較(ng/L，±s)

注:與對照組比較aP＜0.05

組別 動物數 成纖維細胞生長因子(bFGF)血管內皮生長因子(VEGF)實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天 實驗前 損傷后第3天 損傷后第7天 損傷后第14天對照組 8 0.64±0.21 1.06±0.35 1.48±0.69 1.92±0.84 1.32±0.64 1.47±0.64 1.64±0.92 2.03±1.04實驗組 8 0.67±0.23 1.33±0.42a 2.07±0.81a 2.65±1.02a 1.35±0.68 1.83±0.82a 2.23±1.08a 2.96±1.12a

基質金屬蛋白酶家族(MMPs)與金屬蛋白酶組織抑制劑(TIMPs)是調節膠原代謝的主要酶類，MMPs是一類活性依賴于金屬鋅離子的蛋白酶，是降解I、II、III型膠原的關鍵酶，對創面的膠原降解起著重要作用，MMPs的活性主要受到TIMPs的抑制，TIMPs能夠減少膠原的過度降解，TIMPs不足可導致創面不愈合。MMPs與TIMPs在創面的愈合過程中均起到了十分重要的作用［13］。bFGF能夠直接作用于成纖維細胞與血管內皮細胞上的特異性受體，促進這類細胞發生分裂增殖，bFGF能夠促進毛細血管的增生，改善創面局部的微循環與營養狀況，增加肉芽組織的沉積，促使其由創緣向中心的爬行，起到加速創面修復進程的作用。VEGF是目前已知作用最強的促血管生成細胞生長因子，能夠選擇性地作用于內皮細胞(EC)，促進EC的遷移與增殖，加快創面局部新生血管的形成，從而促進創面的愈合［14-15］。筆者通過臨床觀察證實，與未采用VAC相比，創面腫脹及分泌物得到明顯控制，創面壞死組織的清除與肉芽組織的生長明顯加快;平均愈合時間明顯縮短(P＜0.05);同時損傷后3d、7d和14d創面組織MMP-1和MMP-2 mRNA的表達明顯減少(P＜0.05)，TIMP-1和TIMP-2 mRNA的表達明顯增加(P＜0.05);血清bFGF和VEGF的表達明顯升高(P＜0.05)，這均說明了VAC對兔放射性潰瘍創面組織的愈合起到積極的促進作用。

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