胃癌中TGFβ1和Smad7 mRNA的表達及臨床意義*

張德利， 馬 艷， 李春輝

(承德醫學院附屬醫院麻醉科， 河北 承德 067000)

胃癌的發生是一個多因素、多步驟的過程，涉及到多方面機制。研究表明轉化生長因子 β(TGFβ)/Smads信號通路中任何一個環節出現異常都可能導致信號轉導的紊亂，從而導致胃癌的發生與發展。本研究通過檢測正常胃組織和胃癌中TGFβ1、Smad7基因以及蛋白的表達，分析它們與胃癌分化程度、淋巴結轉移的關系。

1 資料與方法

1.1 研究對象:收集我院2011年12月至2012年9月手術治療后經病理證實的胃癌組織標本60例，同時收集正常胃組織20例(切緣距離腫瘤邊緣10cm以上認為正常胃組織)。60例胃癌患者中，男性38例，女性22例;年齡43－77歲，平均年齡54.8±9.7歲;其中低分化者32例，高中分化者28例;有淋巴結轉移者35例，無淋巴結轉移者25例。

1.2 RT－PCR所用試劑:AMV第一鏈cDNA合成試劑盒(BK1040)(上海生工生物工程技術服務有限公司);引物合成(上海生工生物工程技術服務有限公司);50bp DNA Ladder(北京天根生化有限公司MD108);肌動蛋白(β－actin)上游引物序列:5'－CAT GTA CGT TGC TAT CCA GGC －3'，下游引物序列:5＇－CTCCTTAATGTCACGCACGAT－3'。TGF 1上游引物序列:5'－GGCCAGATCCTGTCCAAGC－3'，下游引物序列:5'－GTGGGTTTCCACCATTAGCAC－3'。Smad7上游引物序列:5’－TTCCTCCGCTGAAACAGGG－3’，下游引物序列:5’－CCTCCCAGTATGCCACCAC －3’。

1.3 方 法

1.3.1 提取RNA及RNA定量:①充分預冷研缽，把組織從液氮罐中取出放入研缽中仔細研磨，控制每例標本質量100mg左右，研磨成粉末狀后，加Trizol試劑1mL，將其擊成碎塊，至1.5mLEP管中，混勻室溫靜置5min，4℃，離心12000rpm10min，將上清移入新EP管。

1.3.2 反轉錄:反轉錄過程:1μg總RNA為模板逆轉錄成cDNA，反轉錄反應條件為:25℃，10min;37℃，50min;70℃，15min;4℃，5min。反轉錄反應體系見表1。

表1 反轉錄體系

1.3.3 聚合酶鏈反應

1.3.3.1 PCR 擴增反應體系，見表 2。

表2 PCR擴增反應體系

1.3.3.2 循環設置:①TGF 1擴增條件:94℃預變性5min，一個循環;94℃ 變性 30s，55℃ 退火 30s，72℃ 延伸30s，共35個循環;72℃總延伸6min。②Smad7擴增條件:94℃預變性5min，一個循環;94℃變性30s，53℃退火45s，72℃延伸 30s，共 30個循環;72℃總延伸6min。③瓊脂糖凝膠電泳結果分析:取20μL擴增產物及6μL的DNA Ladder進行2%瓊脂糖凝膠電泳(120V，45min)，紫外熒光數字成像儀下照像，采用Image pro plus 7.0軟件統計各條帶的積分光密度值，以積分光密度值比值分析各組間差異。

1.4 統計學分析:采用SPSS17.0統計軟件，計量資料用均數±標準差(±s)表示，組間比較用方差分析，以P＜0.05為差異有顯著性。

2 結果

在胃癌組織中，TGFβ1，Smad7 mRNA的表達明顯高于對照組(P＜0.05)，低分化胃癌組織中TGFβ1和Smad7 mRNA水平明顯高于高中分化胃癌組織(P＜0.05)。TGFβ1，Smad7 mRNA的表達與胃癌的分化程度有關(圖1)。見表3。

圖1 TGFβ1、Smad7 mRNA在各組織中的表達(±s，n=6)M:100 bp DNA Marker;1:正常胃癌組織;2:高中分化胃癌組織;3:低分化胃癌組織

表3 TGFβ1 mRNA、smad7 mRNA水平的表達在不同臨床病理特征中的關系

3 討論

TGFβ是重要的細胞因子之一，對細胞分裂和增殖具有抑制作用。研究結果顯示，惡性細胞對TGFβ產生抵抗作用與腫瘤的發生關系密切，TGFβ信號通路一旦改變，對靶細胞失去有效抑制作用，甚至可能促進腫瘤的發展［1］。Smad蛋白家族指的是TGFβ信號傳遞通路中的中轉分子，從胞質進入胞核［2］。Smad7在基礎狀態下大部分位于細胞核中，Smad7是TGFβ信號傳導途徑中必需的下游分子，與多種惡性腫瘤的生物學行為有關。Smad7異常表達，拮抗了TGFβ通路，從而使其不能有效監督腫瘤細胞過度增生，導致腫瘤發生［3］。

TGFβ1調控的基因通常依賴于TGFβ1活化的下游分子R－smad(受體－smad)中的一個，即Smad2或Smad3，Smad3磷酸化和核轉位主要發生在活化的細胞，Smad2激活主要發生在靜止和中間細胞［4］。在炎癥性腸病(IBD)病人腸道內Smad3磷酸化水平下降，伴有Smad7顯著增高。研究結果表明，Smad7可通過抑制Smad3的活化磷酸化、影響Smad3/Smad4異源復合物的形成及核轉位，最終拮抗TGFβ對細胞的生長抑制效應。在腫瘤的發生、發展過程中 TGFβ1與Smad7的表達是互相調節，共同發揮作用的。有研究發現，TGF－β作用較長時間(2d)后，可直接導致興奮性信號分子Smad3的基因表達水平下降，抑制性信號分子Smad7的基因表達水平顯著上升，而使胞內TGF－β信號轉導功能下調，細胞對TGF－β的反應減弱。Smad3功能受高表達Smad7抑制，不能有效啟動介導生長終止基因的轉錄，使細胞生長發生紊亂，從而有可能向惡性化發展［5，6］。此外，在體外正常皮膚成纖維細胞中，TGF－β可使Smad7的表達快速而短暫地被誘導，這就提示Smad7是TGF－β早期即刻基因作用的靶點，作用是自身負反饋調節。說明TGF－β刺激Smads信號通路功能的活化，同時對內源性Smads的表達也起到了潛在的調節作用［7］。

有研究報道TGFβ1在前列腺癌、結腸癌等惡性腫瘤中呈過度表達，其過度表達在腫瘤轉化、進展中起重要作用并與預后相關［8］。本實驗研究發現胃癌組織TGFβ1呈過表達狀態，隨著胃癌臨床病理分期的進展，TGFβ1表達逐漸加強，提示我們TGFβ1有可能促進胃癌的進展。這與Naef等［9］的研究結果一致，另外TGFβ1在腫瘤中高表達的原因還可能由于胃癌組織細胞失去了對TGFβ1的敏感性，導致TGFβ1的反饋性表達升高。近來的報道顯示，Smad7基因擴增與胃癌，結腸癌患者的預后不良有著密切的關系。表明TGF－β信號轉導抑制因子Smad7過表達是腫瘤細胞抵抗TGF－β的生長抑制作用的機制之一。最近的研究還顯示，Smad7可以不依賴于TGF－β而獨立發揮其生物學功能，并與腫瘤細胞凋亡的發生有關。

［1］ Pennis on M，Pasche B.Targeting transforming growth factor－ beta signaling［J］.Curr Opin Oncol，2007，19(6):579 －585.

［2］ Derynck R，Zhang Y E.Smad－ dependent and smad－ independent pathways in TGF － beta family signalling［J］.Nature，2003，425(6958):577 －584.

［3］ Singh P，Wig JD，Srinivasan R.The Smad family and its role in pancreatic cancer［J］.Indian Cancer，2011，48(3):351－360

［4］ Liu C，Gaca MD，Swenson ES，et al.Constitutive nuclear localization of smads in activated cells in TGF－beta－independent［J］Biol Chem，2003，278(13):1172 － 1176.

［5］ Flanders KC.Smads as a mediator of fibrotic response［J］.Int Exp Pathol，2004，85(2):47.

［6］ Monteleone G，Kumberova A，Croft NM，et al.Blocking Smad7 restores TGF－beta1 siganaling in chronic inflammatory bowel disease［J］.Clin Invest，2010，108(4):601 －605.

［7］ Tian F，DaCosta Byfield S，Parks WT，et al.Reduction in Smad2/3 signaling enhances tumorigenesis but suppresses metastasis of breast cancer cell lines［J］.Cancer Res，2003，63(23):8284－8292.

［8］ Fitchev PP，Weislak SM，Lee C，et al.Thrombospondin－1 regulates the normal prostate in vivo through angiogenesis and TGF － beta activation ［J］Lab Invest，2010，90(7):1078－1090

［9］ Naef M，Ishiwata T，Friess H.Differential localization of TGF beta isoforms in human gastric mucosa and overexpression in garstric carcinoma［J］.Int Cancer，2007，71:131 －137.