不同開口餌料對草魚幼魚生長及糖代謝的影響

李 姣 梁旭方 方 劉 易提林 許 艷 孫龍芳 章文婧霍 達 錢艷紅

(華中農業大學水產學院, 農業部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

不同開口餌料對草魚幼魚生長及糖代謝的影響

李 姣 梁旭方 方 劉 易提林 許 艷 孫龍芳 章文婧霍 達 錢艷紅

(華中農業大學水產學院, 農業部淡水生物繁育重點實驗室, 武漢 430070)

碳水化合物是水產飼料三大能源中最廉價的飼料能源, 適當提高飼料中碳水化合物水平可以提高蛋白質的利用率, 節約飼料蛋白質和脂肪[1]。近20年來, 關于魚類糖營養的研究比較活躍, 在糖的生理功能、魚類對飼料糖的利用特點、影響因素和需求量等方面都取得了一定的突破[2]。與陸生動物相比, 魚類對飼料中糖的利用能力較低。魚類是先天性的糖尿病患者, 飼料中糖水平超過一定限度就會引發魚類抗病力低、生長緩慢、死亡率高等癥狀[3]。因此, 魚類糖代謝及利用機理的研究已成為目前的研究熱點。

殷名稱[4]認為早期生活史階段存在著兩個過渡期,即卵黃囊期仔魚(Yolk-sac larva)和變形期仔魚(Transformation larva), 這兩個期間的仔魚, 其形態、生態和生理變化相當劇烈。目前, 國內外關于魚類早期營養干預的研究已經廣泛開展。Geurden等[5]分別在肉食性魚類虹鱒(Oncorhynchus mykiss)早期開口和卵黃囊完全吸收兩個階段進行短期的高糖飼料飼喂, 然后在幼魚期投喂略高于該魚適宜碳水化合物水平的飼料, 發現開口期處理的虹鱒 α-淀粉酶和麥芽糖酶的基因表達都提高了, 而卵黃囊完全吸收時處理的虹鱒只有α-淀粉酶基因表達升高。Fang 等[6]通過在斑馬魚(Danio rerio)早期開口階段混合營養期和外營養期進行短期高碳水化合物飼料投喂, 發現早期營養干預對成年斑馬魚的生長沒有顯著性影響, 但在糖代謝基因的分子、生理生化水平上產生了永久性可塑性的代謝影響。Vagner等[7]通過在兩個飼養溫度下, 幼年歐洲鱸(Dicentrarchus labrax)仔魚孵化后 6—45d投喂低或高含量高度不飽和脂肪酸(HUFA)飼料, 再經過中間 3個月的常規商品飼料養殖后, 發現早期生活史對幼年歐洲鱸的生長性能沒有顯著性影響, 投喂缺乏HUFA飼料對Δ6去飽和酶基因的轉錄具有顯著性的正調節作用, 并且魚體對極性脂類和脂肪酸的利用能力提高。

草魚(Ctenopharynodon idellus)作為我國的特有種,是我國主要的淡水養殖魚類之一。目前, 草魚的養殖產量排在全球淡水養殖產量的第二位, 僅次于銀鯉(Hypophthalmichthys molitrix)[8]。研究草魚幼魚對碳水化合物的利用能力有助于正確評價飼料營養價值。本試驗將在草魚仔魚期飼喂不同開口飼料, 分別為浮游動物、高糖飼料和商品飼料。通過測定生長、血糖、糖原和糖代謝相關基因表達等指標, 來探討草魚仔魚期不同開口餌料對草魚幼魚生長及糖代謝的影響, 為草魚早期營養提供參考。

1 材料與方法

1.1 試驗魚種、餌料和飼養管理

試驗魚苗為湖北省仙桃市排湖漁場同一批孵化的草魚苗, 開口后用于試驗。分別以含量為60%麥芽糊精的配合飼料(自己配置)、商品飼料(購于武漢高龍飼料有限公司)、浮游動物(華中農業大學南湖基地撈取, 顯微鏡下觀察, 確定其構成以輪蟲為主, 并混有少量枝角類)作為試驗餌料, 三種餌料的主要營養成分分析見表1。

每種開口餌料飼喂組設3個平行, 每個平行隨機選擇200尾個體大小均勻的健康草魚, 于室內循環流水過濾水族箱(10.3 L)中進行10d的養殖試驗, 結束后于每個平行組挑選個體大小均勻的健康魚苗各35尾[平均體重為11 mg, 體長為(7.81±0.08) mm], 放入養殖循環系統(350 L)進行為期56d飼養試驗的管理, 投喂草魚幼魚商品飼料(同開口期商品飼料)。

日投喂率為魚體重的2%—4%, 分2次投喂, 8:00—9:00和16:00—17:00各投一次。每次投喂適量, 0.5h后觀察吃食情況, 估計采食量使魚體飽食而無飼料剩余, 并把多余飼料吸出, 浮游動物用60目濾網撈出。水源為曝氣除氯的自來水, 5d換水一次, 每次換水1/3。日夜連續充氣增氧, 飼養過程中每天8:00及16:00各測水溫一次, 維持水溫在25—27℃之間。

1.2 樣品的采集與分析

飼養56d后, 饑餓24h, 隨機從每平行組取10尾魚, 用MS-222(200 mg/L)麻醉魚體, 測量體重和體長; 隨機從每試驗組取10尾魚, 其中4尾使用血糖儀(Accu-Chek Performa, Roche)測量其血糖含量, 另外6尾魚取肌肉, 肝臟各兩份樣品, 做好標記, 一份放入液氮中速凍, 并于–80℃保存, 用于分子生物學測定; 另一份凍存于–20℃用于糖原測定。

1.3 分子生物學測定

引物設計與合成 GK: 上游: 5′-GAAGAGCGAG GCTGGAAGG-3′; 下游: 5′-CAGAATGCCCTTATCCAAA TCC-3′。PEPCK: 上游: 5′-ATCGTCACGGAGAACCAA-3′;下游: 5′-CCTGAACACCAAACTTAGCA-3′。

RNA的抽提 取肝臟50—100 mg, 參照Trizol Reagent (Invitrogen公司)說明書操作, 抽提總RNA。使用紫外分光光度計測定RNA的濃度, 并根據A260/A280值判斷RNA的質量, 判定范圍為1.8—2.0。

RT-qPCR 反轉錄反應使用PrimeScript? RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)(Takara公司)獲得單鏈cDNA。后采用SYBR Green Ⅰ嵌合熒光法進行Real Time PCR擴增反應。熒光定量PCR反應液組成: 5 μL SYBR premix Ex TaqTM(2×)、0.5 μL PCR Forward Primer (10 μmol/L)、0.5 μL PCR Reverse Primer (10 μmol/L)、0.5 μL模板(cDNA溶液)、3.5 μL ddH2O。反應條件: 95℃30s; 95℃ 10s, 57℃ 30s, 40個循環; 72℃ 3min; 融解的反應條件為65—95℃, 每升高0.5℃保持5s讀板記錄熒光量。

1.4 糖原測定

肝(肌)糖原采用試劑盒(南京建成科技有限公司)測法,使用紫外分光光度計, 在波長為620 nm處進行吸光度測定。1.5 數據統計與分析

數據采用SPSS 18.0統計軟件進行單因子方差分析(One-way ANOVA), 多重比較用Ducan’s進行差異顯著性檢驗, 當P＜0.05時, 差異顯著, 結果用平均值±標準誤差表示。基因表達水平以草魚β-actin為內參基因, 應用2–??Ct公式確定mRNA的相對表達量[9]。

2 結果

2.1 不同飼料早期投喂對草魚生長性能的影響

采用3種餌料飼養開口草魚仔魚10d, 后進行56d商品飼料的飼養, 均投喂至飽食, 各試驗組攝食活躍, 其中浮游動物組攝食較兩個飼料組更加活躍, 兩飼料組攝食活躍度無明顯差異(P＞0.05)。各個試驗組的體重和體長數據見表2。試驗結果顯示, 浮游動物組的體重和體長顯著高于高糖飼料組和商品飼料組(P＜0.05), 高糖飼料組與商品飼料組間無顯著性差異(P＞0.05)。

2.2 不同飼料早期投喂對草魚血糖水平和糖原含量的影

響

三種開口餌料飼喂組的血糖水平見表2。商品飼料組血糖水平最高, 高糖飼料組次之, 浮游動物組最低。浮游動物組與高糖飼料組血糖水平無顯著性差異(P＞0.05), 商品飼料組與其他兩組均有顯著性差異(P＜0.05)。

表1 三種飼料主要營養成分Tab. 1 Ingredient formulation of the three diets

表2 八周飼養后的生長及血糖變化Tab. 2 Growth performance and plasma glucose after 8 weeks feeding experiment

三種開口餌料飼喂組的肝糖原含量見圖1。本研究發現, 商品飼料組肝糖原含量最高, 且與其他兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。高糖飼料組次之, 浮游動物組最低。兩組之間無顯著性差異(P＞0.05)。肌糖原含量見圖 2。商品飼料組肌糖原含量最高, 浮游動物組次之, 高糖飼料組最低。并且, 三組之間有顯著性差異(P＜0.05)。

2.3 不同飼料早期投喂對GK、PEPCK基因表達的影響

三種開口餌料飼喂組的GK基因相對表達量見圖3。以浮游動物組為對照, GK基因的表達量為1.114 ± 0.58,顯著性低于其他兩組(P＜0.05), 商品飼料組表達最高, 高糖飼料組次之, 且兩組之間表達量無顯著性差異(P＞0.05)。

三種開口餌料飼喂組的PEPCK基因表達量見圖4。以浮游動物組為對照, PEPCK基因的表達量最高, 為1.144 ± 0.64, 商品飼料組次之, 高糖飼料組最低, 三組之間無顯著性差異(P＞0.05)。

圖1 不同處理組之間的肝糖原含量Fig. 1 Effects of different diets on hepatic glycogen contents

圖2 不同處理組之間肌糖原含量Fig. 2 Effects of different diets on muscle glycogen contents

圖3 不同處理組之間GK mRNA表達Fig. 3 Effects of different diets on GK gene expression

3 討論

魚類在仔魚期形態、生態和生理變化相當劇烈[4], 研究該時期營養刺激對機體或各器官功能可能產生的長期影響具有重要的理論與實踐意義。

圖4 不同處理組之間PEPCK mRNA表達Fig. 4 Effects of different diets on PEPCK gene expression

Geurden 等[5]對肉食性魚類虹鱒仔魚期的短期高糖刺激發現, 幼年虹鱒的葡萄糖激酶(GK)等糖代謝相關基因表達出現上調, 認為高糖刺激可對虹鱒的糖酵解途徑產生長期的影響。本試驗室對斑馬魚進行了早期高糖飼喂,提高了GK的表達量, 降低了PEPCK表達量, 可認為早期高糖刺激可以增強糖酵解能力, 抑制糖異生能力[6]。本試驗以草魚為研究對象, 在仔魚期以高糖短期刺激, 以確定是否能夠提高草魚幼魚在碳水化合物利用率方面的長期持久性的代謝變化的可能性。

3.1 不同飼料早期投喂對草魚生長性能的影響

魚類在仔魚期食性由混合營養期逐漸過渡到外營養期, 消化代謝能力發生劇烈的變化, 以確保能夠高效利用外來營養[10]。當卵黃囊不再能滿足幼魚代謝需要, 它們必須開始攝取外來營養。研究證明, 多數魚類在仔魚階段的食性為肉食性, 然后才逐漸分化為各種不同的食性[4]。在自然條件下, 草魚以浮游動物為開口餌料, 故選用浮游動物組作為對照。在飼喂微顆粒飼料后, 商品飼料組和高糖飼料組的草魚的體重和體長顯著低于浮游動物組(P＜0.05), 出現該結果一方面可能由于浮游動物組攝食較兩個飼料組活躍, 另一方面可能是微顆粒飼料在草魚仔魚期不能滿足草魚仔魚期的營養需求。

3.2 不同飼料早期投喂對草魚血糖水平和糖原含量的影響

血糖水平是反映動物糖代謝和全身組織細胞功能狀態以及內分泌機能的一個重要指標, 同時也可以反映餌料和營養是否適當、肝臟機能是否良好[2]。有研究表明,在發育的關鍵或敏感時期的營養刺激會對虹鱒機體或各器官功能產生長期的影響, 可能對魚體利用碳水化合物具有促進作用[5]。本實驗室在對斑馬魚的研究中發現, 與對照組相比, 仔魚期的短期高糖飼喂可有效降低成年斑馬魚糖耐量后的血糖水平[6], 本試驗也得到了與上述研究結果類似的結果, 高糖飼料組血糖水平顯著低于商品飼料組(P＜0.05), 這可能是由于葡萄糖被魚體組織吸收,或是葡萄糖磷酸化水平得到了提高。高糖飼料組與浮游動物組血糖水平無顯著性差異(P＞0.05), 說明高糖飼料作為開口餌料可與草魚在自然條件下攝食浮游動物一樣, 能有效地調節血糖水平。

血糖水平是由生成速率和消除速率共同決定的, 而有關糖類代謝去路包括糖原的合成、脂肪合成、代謝甚至排泄[11]。付世建[11]對南方鲇(Silurus meridionalis Chen)飼喂高糖飼料時, 認為糖原的合成和分解在同時進行, 一方面為了快速清除高血糖水平, 糖原合成途徑活躍; 另一方面由于肝臟糖原庫容量有限, 在長期高糖飼料喂養下, 肝臟糖原在攝食前已很高, 因此糖原在不斷動員和分解以騰空糖原庫。肝臟糖原含量的變化, 取決于兩個方向反應的活躍程度及相對大小的變化。普遍認為肝糖原的合成與分解主要是為了維持血糖濃度的相對恒定[12], 但是, 由于大多數魚類不能很好地利用魚體糖原作為代謝能源物質, 這種積累的糖原只是魚體在高血糖條件下的被動適應, 即儲存起來以免對機體造成危害, 積累的糖原只能通過某種途徑加以清除, 因此肝糖原可能成為魚體的代謝負擔[11]。高糖飼料組肝糖原含量與浮游動物組沒有顯著性差異(P＞0.05), 商品飼料組顯著高于其他兩組(P＜0.05), 以浮游動物組為健康的蓄積量, 可認為高糖飼料組儲存肝糖原含量較商品飼料組產生的代謝負擔小。在肌肉中糖原的合成與分解主要是為肌肉提供 ATP[12], 有學者認為肌肉糖原含量與攝入的飼料糖沒有顯著相關性,高糖飼料不會引起肌肉糖原的明顯增加[13]。高糖飼料組肌糖原含量顯著低于浮游動物組(P＜0.05), 筆者認為早期高糖刺激并不能提高草魚幼魚肌糖原的儲存能力。而商品飼料組肌糖原顯著高于其他兩組(P＜0.05), 這可能與商品飼料中較高的脂肪含量有關。

3.3 不同飼料早期投喂對GK、PEPCK基因表達的影響

有研究表明, 魚類飼料中碳水化合物含量對一些糖代謝酶的基因表達具有調控作用[14]。糖代謝酶在肝臟中的合成速度與其mRNA水平密切相關, 而mRNA又受到基因轉錄及mRNA本身穩定性的控制[15]。

葡萄糖激酶(GK)是糖酵解過程在肝臟中調節血糖的重要的限速酶。試驗中浮游動物組GK mRNA表達量最低,且與其他兩組之間有顯著性差異(P＜0.05)。此試驗結果與之前在虹鱒上發現的結果一致[5]。這些發現可說明葡萄糖激酶可受到早期營養刺激的影響發生變化。機體在饑餓狀態下, GK mRNA表達量上升, 糖酵解能力增強, 進而分解葡萄糖供能。商品飼料組GK mRNA表達量高于高糖組,但并無顯著性差異(P＞0.05), 這與Capilla等[16]認為虹鱒GK的表達量和活性隨飼料碳水化合物含量按比例增加的結論相悖。初步推測, 飼料中碳水化合物含量達到閾值,則對草魚肝臟GK基因表達不產生顯著性影響。

磷酸烯醇式丙酮酸激酶(PEPCK)是肝和腎中糖原異生的關鍵酶, 主要在肝臟、腎臟和脂肪組織中表達[15]。它可催化草酰乙酸轉化為磷酸烯醇式丙酮酸, 其轉錄水平的高低, 決定了糖異生的速度[17, 18]。試驗發現, 浮游動物組、商品飼料組和高糖飼料組三組PEPCK mRNA表達量無顯著性差異(P＞0.05), 這與 Panserat等[19]對虹鱒、Tranulis等[20]對大西洋鮭(Salmo salar)、Borrebaek等[21]對河鱸(Perca fluviatilis)的研究結果相同, 可認為早期高碳水化合物刺激不能影響草魚 PEPCK的 mRNA表達水平, PEPCK的表達水平不受飼料碳水化合物的反饋抑制[22, 23]。因此, 一些研究者提出, 魚類對血糖水平的調控能力低可能與攝食碳水化合物后魚體缺乏糖異生酶的調控有關[24]。

本試驗在草魚仔魚期短期高糖刺激后, 降低了血糖水平, 促進了肝臟GK基因的表達, 說明短期高碳水化合物刺激可增強草魚的糖代謝過程, 提高草魚幼魚對糖的利用能力, 但影響糖代謝的機理仍需進一步研究。

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EFFECTS OF INITIAL FEEDING ON THE GROWTH AND GLUCOSE METABOLISM OF JUVENILE GRASS CARP (CTENOPHARYNODON IDELLUS)

LI Jiao, LIANG Xu-Fang, FANG Liu, YI Ti-Lin, XU Yan, SUN Long-Fang, ZHANG Wen-Jing, HUO Da and QIAN Yan-Hong
(Key Lab of Freshwater Animal Breeding, Ministry of Agriculture, College of Fisheries, Huazhong Agricultural University, Wuhan 430070, China)

開口餌料; 糖代謝; 草魚

Initial feeding; Glucose metabolism; Grass carp (Ctenopharynodon idellus)

S965.1

A

1000-3207(2015)04-0811-05

10.7541/2015.106

2014-03-26;

2014-11-25

全國大學生創新創業訓練計劃創新訓練項目(201210504173); 淡水健康養殖關鍵技術與集成示范(2012BAD25B04)資助

李姣(1991—), 女, 河北省張家口人; 碩士研究生; 主要從事健康養殖研究。E-mail: 345750141@qq.com

梁旭方(1965—), 男, 博士, 教授; E-mail: xufang_liang@hotmail.com