松茸濃縮口服液制備過程中堿性蛋白的提取研究

么宏偉，佟立君，付婷婷，張學(xué)義*，謝晨陽，吳洪軍，趙鳳臣，馮 磊

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

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松茸濃縮口服液制備過程中堿性蛋白的提取研究

么宏偉1，佟立君2，付婷婷1，張學(xué)義1*，謝晨陽1，吳洪軍1，趙鳳臣1，馮 磊2

(1.黑龍江省林副特產(chǎn)研究所黑龍江省非木質(zhì)林產(chǎn)品研發(fā)重點實驗室，黑龍江牡丹江 157011；2.黑龍江省林業(yè)科學(xué)院，黑龍江哈爾濱 150081)

[目的] 優(yōu)化松茸濃縮口服液制備過程中堿性蛋白的提取工藝。 [方法]以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營養(yǎng)物質(zhì)，制備成了松茸濃縮口服液；并以弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白，對影響因素碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時間、提取溫進行了正交試驗分析，確定最佳工藝。 [結(jié)果]試驗確定了弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白的最佳工藝為：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時間150 min，提取溫度80 ℃；此條件下堿性蛋白質(zhì)的得率為1.16%。[結(jié)論] 試驗打破了松茸在傳統(tǒng)口服液中利用率低的局限性，通過改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，大大提高了松茸的利用價值與經(jīng)濟效益。

松茸；提取方法；堿性蛋白

松茸[Tricholomamatsutake(S.Ito et Imai)Sing]，又名松口蘑，與溫帶和寒溫帶的松林與櫟林共生生長，為共生菌[1]。野生松茸的生長環(huán)境極為苛刻，需要依賴柏樹、橡樹等闊葉林為其生長發(fā)育提供營養(yǎng)支持，只有這樣才能形成健康的子實體[2-3]。松茸含有豐富的氨基酸、維生素和脂肪及豐富的膳食纖維和多種活性酶，另含有3種珍貴的活性物質(zhì)，分別是雙鏈松茸多糖、松茸多肽和松茸醇[4-5]。松茸有很多保健功能，如提高免疫力、抗癌抗腫瘤、治療糖尿病及心血管疾病、抗衰老養(yǎng)顏和促腸胃保肝臟等多種功效[6-8]。筆者以新鮮松茸為原料，利用超聲波輔助水提、弱堿鹽溶液提取和醇溶液提取三步提取法提取松茸中的營養(yǎng)物質(zhì)，并制備成了松茸濃縮口服液。試驗打破了松茸在傳統(tǒng)口服液中利用率低的局限性，通過改變提取方式，增加了松茸濃縮液的提取率，并結(jié)合口服液使用簡單、方便，便于保藏等優(yōu)勢，大大提高了松茸的利用價值與經(jīng)濟效益。其中以弱堿鹽溶液提取松茸堿性蛋白，在試驗中對碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時間、提取溫度4個因素進行正交試驗和分析，確定最佳工藝。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1供試原料。試驗所需松茸來源于黑龍江省牡丹江市東寧縣。

1.1.2主要試劑。檸檬酸、正丁醇、肉豆蔻酯、EDTA、檸檬酸鈉、纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶、碳酸鈉、氯化鈉、95%乙醇、葡萄糖、濃硫酸、苯酚、草酸、維生素C、偏磷酸、醋酸、氯酸銨、蘆丁、亞硝酸鈉、硝酸鋁、氫氧化鈉、牛血清白蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、沒食子酸、福林酚、熊果酸、香草醛、冰醋酸、高氯酸等試劑，均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3主要儀器與設(shè)備。試驗所用主要儀器設(shè)備見表1。

表1 主要試驗儀器

1.2 試驗方法

1.2.1原材料預(yù)處理。選擇新鮮、無病殘、無蟲蛀的松茸，于清水中洗凈，瀝水。將松茸子實體進行切片處理；用電子天平稱量重量，加入20倍體積無菌蒸餾水，將切片后的松茸減壓浸漬在含有0.03%的檸檬酸、0.02%正丁醇與0.02%肉豆蔻酯的混合溶液中，減壓浸漬10 min。加入0.02%EDTA、0.2%檸檬酸鈉，用組織搗碎器將組織破壞。加入纖維素酶、果膠酶、木瓜蛋白酶，按6.8 g/L加入，3種酶的比例為1∶1∶1.4。

1.2.2弱堿鹽溶液提取工藝。

1.2.2.1弱堿鹽溶液提取工藝的優(yōu)化。為了得到松茸中的堿溶性成分，將超聲波輔助水提取后的殘渣用碳酸氫鈉與氯化鈉混合溶液進行提取，以堿性蛋白質(zhì)的得率為檢測指標確定最佳工藝。

以堿性蛋白質(zhì)的提取率為檢測指標，稱取超聲波輔助水提取后的殘渣50 g，分別改變提取條件(碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時間、提取溫度)4個因素，考察各因素對總提取率的影響，各因素水平設(shè)置如下：碳酸氫鈉濃度：0.1%、0.2%、0.3%、0.4%、0.5%；氯化鈉濃度：0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%；提取時間：30、60、90、120、150 min；提取溫度：50、60、70、80、90 ℃。

在上述單因素試驗的基礎(chǔ)上，運用L9(34)正交表，由碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時間、提取溫度作正交表，因素水平見表2。

表2 弱堿鹽溶液提取工藝的正交試驗

1.2.2.2堿溶性物質(zhì)總得率的計算。蛋白質(zhì)標準曲線的繪制：首先將牛血清白蛋白用0.15 mol/ml的氯化鈉溶液配成1.0 mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液。再準確稱取100 mg考馬斯亮藍G-250，溶于50 ml 95%的乙醇后，加入120 ml 85%的磷酸，用蒸餾水稀釋至1 L。取6支試管分別加入1.0 mg/ml的標準蛋白質(zhì)溶液0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6 ml，然后用0.15 mol/ml氯化鈉溶液補充到1.0 ml，最后各試管分別加入5.0 ml考馬斯亮藍G-250試劑。每加完一管，立即在旋渦混合器上混勻。加完試劑2～5 min后，于595 nm處測吸光值。以牛血清白蛋白濃度(mg/ml)為橫坐標，以吸光值(OD595)為縱坐標，如圖1所示。

堿溶性蛋白質(zhì)得率的計算：取1 ml提取液，按照上述標準曲線方法測定吸光值，根據(jù)標準曲線求出提取液中堿溶性蛋白質(zhì)的濃度，可計算：

堿溶性蛋白質(zhì)得率=提取液中堿溶性蛋白質(zhì)量/松茸質(zhì)量×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 碳酸氫鈉濃度對蛋白質(zhì)得率的影響在一定范圍內(nèi)，堿液可以使堿溶性蛋白質(zhì)析出，但是當(dāng)堿液濃度過大時，則可能使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，從而影響得率，結(jié)果如圖2所示。

由圖2可知，堿溶性蛋白質(zhì)的得率在碳酸氫鈉濃度為0.3%時達到最大。碳酸氫鈉濃度小時，松茸中的堿溶性蛋白質(zhì)并沒有完全溶解到溶液中；而碳酸氫鈉濃度大時可能會導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性影響得率。所以，以碳酸氫鈉濃度0.3%為宜。

2.2 氯化鈉濃度對蛋白質(zhì)得率的影響低濃度的氯化鈉可以改變細胞膜表面的通透性，而高濃度的氯化鈉則會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性，所以氯化鈉的濃度對蛋白質(zhì)的得率有一定的影響，結(jié)果如圖3所示。

由圖3可知，堿溶性蛋白質(zhì)的得率在氯化鈉濃度為1.0%時達到最大，而后隨著氯化鈉濃度增大而減少?？赡苁怯捎诼然c濃度過大導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性影響得率。所以，以氯化鈉濃度1.0%為宜。

2.3 提取時間對蛋白質(zhì)提取率的影響提取時間直接反映溶液對松茸的作用效果，只有達到一定的提取時間，才能使松茸中的堿溶性成分最大的浸出，結(jié)果如圖4所示。

由圖4可知，隨著提取時間的增加，蛋白質(zhì)的得率也逐漸增加，當(dāng)提取時間達到120 min時，得率基本保持不變，從消耗能源和蛋白質(zhì)得率考慮，以提取時間120 min為宜。

2.4 提取溫度對蛋白質(zhì)得率的影響溫度會影響溶液的熱效應(yīng)，高溫可以使溶液中的水分子運動加速，有利于蛋白質(zhì)的溶解，但是溫度過高會使蛋白質(zhì)發(fā)生變性反應(yīng)降低得率，結(jié)果如圖5所示。

由圖5可知，隨著提取溫度的增加，蛋白質(zhì)的得率也逐漸增加，當(dāng)提取溫度達到70 ℃時，得率基本保持不變，從消耗能源和蛋白質(zhì)得率考慮，以提取溫度70 ℃為宜。

2.5 弱堿鹽溶液提取工藝正交試驗為得到最優(yōu)提取條件而進行正交試驗，設(shè)計了3水平4因素的正交試驗優(yōu)化提取工藝，具體試驗方案與結(jié)果分析見表3。由表3可以看出，通過極差分析，得到因素顯著性主次順序為溫度>時間>氯化鈉水濃度>碳酸氫鈉濃度。比較試驗結(jié)果可以得出4個因素的最佳組成為：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時間150 min，提取溫度80 ℃。方差分析顯示，F(xiàn)A=1.000，F(xiàn)B=7.750，F(xiàn)C=10.875，F(xiàn)D=21.000，F(xiàn)臨界值=19.000。結(jié)果表明，溫度對弱堿鹽提取的影響達到顯著水平(P<0.05)。

在最佳工藝條件下測得弱堿鹽提取液中的堿性蛋白質(zhì)得率為1.16%。

3 結(jié)論

為了得到松茸中的堿性蛋白成分，用碳酸氫鈉與氯化鈉混合溶液進行提取，以堿性蛋白質(zhì)的得率為檢測指標確定最佳工藝。分別改變提取條件(碳酸氫鈉濃度、氯化鈉濃度、提取時間、提取溫度)4個因素，考察各因素對總提取率的影響，通過單因素及正交試驗得到了松茸堿性蛋白提取的最優(yōu)條件和測定計算了堿性蛋白。弱堿鹽溶液提取堿性蛋白質(zhì)的最佳提取工藝：碳酸氫鈉濃度0.3%，氯化鈉濃度0.5%，提取時間150 min，提取溫度80 ℃；此條件下堿性蛋白質(zhì)的得率為1.16%。

表3 弱堿鹽溶液提取率正交設(shè)計試驗結(jié)果

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Extraction of Alkaline Protein in the Preparation Process of Condensed Oral Liquid ofTricholomamatsutake

YAO Hong-wei1, TONG Li-jun2, FU Ting-ting1, ZHANG Xue-yi1*et al

(1. Heilongjiang Provincial Key Laboratory of Non-wood Forest Product Development, Heilongjiang Forest By-Product and Speciality Research Institute, Mudanjiang, Heilongjiang 157011; 2. Heilongjiang Academy of Forestry, Harbin, Heilongjiang 150081)

[Objective] To optimize extraction technique of alkaline protein in preparation process ofTricholomamatsutakecondensed oral liquid. [Method] With freshTricholomamatsutakeas raw material, using ultrasonic extraction, weak base salt solution extraction and alcohol solution to extract nutrients ofTricholomamatsutake; weak base salt solution was adopted to extract alkaline protein, orthogonal test was used to analyze influencing factors of sodium bicarbonate concentration, sodium chloride, extraction time, extraction temperature. [Result] The optimum process is as follows: sodium salt solution concentration of 0.3%, saline concentration of 0.5%, extraction time 150 min, extraction temperature 80 ℃; weak base yields an alkaline salt solution extracted proteins reach 1.16%. [Conclusion] Through changing extraction method, yield ofTricholomamatsutakeconcentrated liquid was improved, which significant increase utilization value and economic benefit ofTricholomamatsutake.

Tricholomamatsutake; Extraction method; Alkaline protein

黑龍江省森林工業(yè)總局科技攻關(guān)項目(sgzjY2012022)。

么宏偉(1981- )，男，黑龍江牡丹江人，助理研究員，從事林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)研究。*通訊作者，研究員，從事林產(chǎn)化學(xué)加工學(xué)研究。

2015-01-13

S 646.1+5

A

0517-6611(2015)06-267-03