Cox-2、nm23和MMP-3在直腸小細胞癌中的表達及臨床意義

張劍虹　張飛　張曉麗　孫忠哲

Cox-2、nm23和MMP-3在直腸小細胞癌中的表達及臨床意義

張劍虹張飛張曉麗孫忠哲

【摘要】目的探討直腸小細胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表達及與臨床病理特征的關系。方法應用免疫組織化學方法及組織芯片技術，觀察63例直腸小細胞癌Cox-2、nm23和MMP-3的表達情況。結果Cox-2、MMP-3陽性表達率與直腸小細胞癌的浸潤深度、腸系膜淋巴結轉移有關，隨浸潤深度加深，淋巴結轉移率增加而升高( P＜0．05)。Cox-2、MMP-3陽性表達率與直腸小細胞癌的TNM分期無關( P＞0．05)，nm23蛋白的陽性表達與腸系膜淋巴結轉移，TNM分期有關，隨淋巴結轉移，TNM分期的增加而減低( P＜0．05)，與浸潤深度無關( P＞0．05)。Cox-2、nm23和MMP-3的表達與患者年齡、性別無關( P＞0．05)。結論直腸小細胞癌的nm23、Cox-2和MMP-3的表達與臨床預后密切相關，聯合檢測可預測直腸小細胞癌的惡性程度及判斷預后。

【關鍵詞】環氧合酶;基質金屬蛋白酶;組織芯片;免疫組化;直腸小細胞癌

直腸小細胞癌惡性度高，侵襲性強，常侵達壁漿膜外及遠隔器官，其轉移機制不清，癌細胞的侵襲性與新血管的生成，細胞外基質降解等因素密切相關。環氧合酶( Cox-2)在細胞的凋亡和腫瘤發生中起一定作用;腫瘤抑制基因( nm23)與多種惡性腫瘤的浸潤和轉移有關;基質金屬蛋白酶( MMP-3)通過參與降解細胞外基質和基底膜參與直腸小細胞癌的發生，發展。本實驗應用免疫組織化學方法及組織芯片技術，觀察Cox-2、nm23和MMP-3在63例直腸小細胞癌中表達，研究癌細胞的浸潤，轉移分子機制，為臨床治療提供相關依據。

1　資料與方法

1．1一般資料選取河北北方學院附屬第一醫院

2010年1月至2012年10月手術后經病理診斷為直腸小細胞癌標本63例，其中男28例，女35例;年齡34～75歲，平均54．5歲;≥50歲41例，＜50歲22例;浸潤深度未侵及漿膜26例，侵及漿膜37例;有腸系膜淋巴結轉移33例，無腸系膜淋巴結轉移30例;按TNM標準分類，Ⅰ+Ⅱ期27例，Ⅲ+Ⅳ期36例，所有病例均無手術斷端腫瘤殘留。

1．2標本處理及診斷所有標本術前均未進行化療、放療及免役治療，手術切除新鮮直腸小細胞癌標本，經10%中性甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚連續切片，兩位有經驗病理醫師顯微鏡下診斷為黏液腺癌。

1．3組織芯片制備組織芯片委托試劑公司在天津腫瘤醫院腫瘤研究所完成，過程如下:組織載玻片經過夜泡酸，充分清洗并烘干，用多聚賴氨酸行防脫片處

理，對每一組織標本，觀察HE切片，選取目標組織并在HE切片及其相應石蠟組織塊(供體蠟塊)上標記，萊卡石蠟空白蠟塊(受體蠟塊)與蜂蠟混合(比例為1∶1)，制成2．2 cm×3．5 cm×1 cm大小蠟塊，用加拿大生產CDX718組織芯片儀打孔制成帶孔空白蠟塊，將蠟塊放在39～42℃水浴中軟化后，用組織芯片儀從供體蠟塊標記部位逐個取出直徑1 mm高4 mm的組織柱，推入空白蠟塊預先設計的相應孔內，這樣在空白蠟塊上制作完成了68個組織芯片，為防止染色過程中脫片，每例標本上樣四個點，分別安插在空白蠟塊1和2中，對蠟塊進行連續切片，裱于防脫片處理的載玻片上。

1．4免疫組織化學染色nm23、Cox-2、MMP-3抗體濃縮液均購自北京中杉金橋生物技術有限公司，按不同比例稀釋后進行預實驗，選擇最佳稀釋比例。應用免疫組化S-P法進行，實驗過程均由同一病理技師操作完成，梁色步驟:石蠟切片常規脫蠟，水化，加3%過氧化氫甲醇溶液50 μl，阻斷過氧化物酶后，加熱修復抗原10 min，加10%正常山羊血清封閉，室溫溫育10 min，加第一抗體，室溫溫育120 min，加生物素標記的第二抗體50 μl，室溫溫育10 min，加辣根酶標記的鏈酶卵白素溶液50 μl，，室溫溫育10 min，加新鮮配制DAB溶液100 μl顯色。以上各步驟之間均用緩沖液沖洗3次，共15 min，蘇術精對比染色、脫水、透明、封固，鏡下觀察。

1．5陽性判斷標準陽性結果判斷根據以下兩方面的總分進行判斷: ( 1)選染色均勻的陽性表達區域，5個高倍視野計數陽性細胞，以陽性細胞所占百分比為5級計分:陽性細胞率＜5%為0分;陽性細胞率5%～25%為1分;陽性細胞率26%～50%為2分;陽性細胞率51%～75%為3分，陽性細胞率＞75%為4分。( 2)按染色強度來分:不著色為0分，淺黃色為1分，棕黃色為2分，黃褐色為3分。兩種評分相加，0～1分為陰性(－)，2～3分為弱陽性( + )，4～5分為陽性( + + )，6～7分為強陽性( + + + )，以上方法均由2名有經驗的高年資病理醫師采用雙盲法獨立檢測，取平均值。Cox-2的表達以細胞質和(或)細胞膜出血棕黃色顆粒為陽性，MMP-3的表達以細胞核出現棕色為陽性。光鏡下隨機計數5個高倍視野，當陽性染色癌細胞≤25%定為陰性表達，＞25%定為陽性表達。

1．6統計學分析應用SPSS 6．12統計軟件，計數資料采用χ2檢驗和線性相關分析，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1Cox-2在直腸小細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的關系在直腸小細胞癌組織中表達的陽性率為57．14%( 36/63)，分布特點: Cox-2陽性細胞可見細胞漿內淺-棕黃色顆粒，密度較均勻，與血管走行無規律性。Cox-2陽性在直腸小細胞癌侵及漿膜和未見侵及漿膜2組間比較(χ2= 6．31，P＜0．05) ;腸系膜淋巴結轉移和未見轉移2組間比較(χ2= 9．81，P＜0．05)。Cox-2陽性表達率隨直腸小細胞癌浸潤深度，淋巴結轉移增加而升高。Cox-2在直腸小細胞癌中陽性表達與TNM分期無相關性( P＞0．05)。見表1、圖1。

2．2nm23在直腸小細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的關系nm23在直腸小細胞癌組織中陽性表達率為49．21%( 31/63)，分布特點: nm23陽性細胞可見細胞漿淺-黃色顆粒，與血管走行無規律性，密度分布不均勻。nm23陽性率在腸系膜淋巴結轉移和未見轉移2組間比較(χ2=6．99，P＜0．05)，在TNM分期Ⅲ+Ⅳ期與Ⅰ+Ⅱ期組間比較(χ2= 8．47，P＜0．05)。nm23陽性率隨淋巴結轉移，TNM分期的增加而降低。nm23陽性率與浸潤深度無相關性( P＞0．05)。見表1，圖2。

2．3MMP-3在直腸小細胞癌組織中的表達與臨床病理特征的關系MMP-3在直腸小細胞癌組織中表達的陽性率為61．90% ( 39/63)，分布特點: MMP-3陽性細胞可見細胞漿淺-黃色顆粒，與血管走行無規律性，密度分布較均勻。MMP-3侵及漿膜和未見侵及漿膜2組間比較(χ2= 6．02，P＜0．05) ;腸系膜淋巴結轉移和未見轉移2組間比較(χ2=5．64，P＜0．05)。MMP-3陽性表達隨浸潤深度，淋巴結轉移增加而升高。MMP-3陽性表達與TNM分期無相關性( P＞0．05)。見表1，圖3。

2．4Cox-2、nm23、MMP-3的陽性表達率與直腸小細胞癌患者的年齡，性別的關系Cox-2、nm23、MMP-3的陽性表達率與直腸小細胞癌患者的年齡、性別的關系無關( P＞0．05)。見表1。

3　討論

直腸小細胞癌惡性度高，容易局部侵襲，淋巴道擴散及遠處轉移，患者預后差，探索其轉移機制十分必要。腫瘤較強的增殖，侵襲特性與腫瘤細胞分裂旺盛，細胞間黏附力改變，降解基質及微血管新生等因素有關。本實驗分別研究Cox-2、nm23和MMP-3與直腸小細胞癌的生物學行為的相關性。

環氧合酶( cyclooxygenase，COX)又稱為環氧化酶和PG內過氧化物合成酶。是催化花生四烯酸轉化為前列腺素( PG)合成過程中的一個關鍵限速酶。高含

量的PG可加速腫瘤組織增值、侵襲、轉移。Cox-2可通過刺激腫瘤細胞增殖，抑制細胞凋亡，抑制細胞免役功能等促進癌前病變向腫瘤轉化，可以通過促進脈管形成參與浸潤，轉移。Cox-2可通過誘導血管內皮生長因子的表達來增加腫瘤血管的生成，生長，侵襲。Cox-2在細胞的凋亡和腫瘤發生中起一定作用。近年發現多器官惡性腫瘤均有Cox-2的高表達。羅瓊等［1］發現Cox-2在卵巢癌中的表達明顯高于卵巢良性腫瘤和正常卵巢組織，并與淋巴結轉移有關。張帥等［2］發現具有淋巴結轉移的甲狀腺癌的Cox-2表達顯著高于無淋巴結轉移的癌組織。本研究檢測了63例直腸小細胞癌Cox-2的表達，發現浸潤至漿膜層的Cox-2表達率為70．27%，與未浸潤至漿膜組的病例相比( 38．46%)，差異有統計學意義( P＜0．05) ;有淋巴結轉移組Cox-2表達率為75．76%，顯著高于無淋巴結轉移組( 36．67%)，差異亦有統計學意義( P＜0．05)。顯示Cox-2高表達的病例腫瘤細胞生長快，不易凋亡，Cox-2通過誘導腸壁肌層-漿膜層等腫瘤內小血管的新生，使癌細胞容易浸潤。Cox-2蛋白的高表達可促進癌組織的快速增殖，向遠隔器官的播散及淋巴道的轉移，Cox-2可作為預后不良的參考因素。

圖1　直腸小細胞癌的Cox-2的表達( SP× 200)

圖2　直腸小細胞癌的nm23的表達( SP× 200)

圖3　直腸小細胞癌的MMP-3的表達( SP× 200)

表1　Cox-2、nm23、MMP-3在直腸小細胞癌組織中的

nm23基因是近年來發現并被證實與多種腫瘤轉移有關的腫瘤抑制基因，現已檢測出三種亞型: nm232H1、nm232H2、nm232H3。主要是nm232H1發揮作用，其表達與多種惡性腫瘤的浸潤和轉移有關。nm23的作用機制包括:作為一種分泌蛋白，具有細胞因子的功能，介導細胞吞噬功能及運動活性，并調節細胞正常發育和分化。nm23的同源基因awd參與CTP激活蛋白的作用，awd的突變或表達下調可導致異常分化，廣泛畸形及癌變，甚至在前蛹期死亡［3］。高艷等［4］發現隨結腸癌浸潤的加深，其陽性表達逐漸降低，有淋巴結轉移者的陽性表達較無淋巴結轉移者顯著降低。本研究中我們檢測了63例直腸小細胞癌nm23的表達，淋巴結轉移組nm23陽性率33．33%，低于無淋巴結轉移組( 66．67%)，TNM分期為Ⅲ+Ⅳ期組nm23陽性率33．33%，低于分期為Ⅰ+Ⅱ期組，差異均有統計學意義( P＜0．05)。顯示nm23表達下調使正常免疫細胞對機體免疫調節功能減低，使失去調節的癌細胞生長旺盛，具備了更強的侵襲和轉移能力，同時nm23的同源基因awd激活了CTP蛋白，使直腸正常細胞癌變數量增多，廣泛癌變細胞無限制生長，侵犯周圍腸壁血管，肌纖維及淋巴結。nm23表達率越低，其淋巴結轉移率越高，TNM分期越高。nm23在直腸小細胞癌轉移中發揮負性調節作用。

基質金屬蛋白酶( matrix metalloproteinases，MMPs)是一組鋅離子依賴性內肽酶，可以降解不同的細胞外基質［5］。MMP-3是MMP-s的一員，是人體內降解ECM的主要酶類，MMP-3通過參與降解細胞外基質和基底膜，并激活與腫瘤浸潤和轉移有關的其他MMP-s、N-cadherin等參與癌腫的發生、發展。于秀文等［6］發現結腸癌中MMP-3的表達增加，MMP-3與結腸癌分化程度，浸潤深度無關，而與淋巴結轉移呈正相關。本研究發現MMP-3在直腸小細胞癌中高表達，浸潤至漿膜層的MMP-3表達率為62．16%，與未浸潤至

漿膜層的病例相比( 30．76%)，差異有統計學意義( P ＜0．05) ;有淋巴結轉移的病例其陽性率為67．56%，與無淋巴結轉移組相比( 46．67%)，差異亦有統計學意義( P＜0．05)。顯示MMP-3表達越高，越容易激活與直腸小細胞癌浸潤和轉移有關的其他MMP-s、N-cadherin等，使癌細胞越容易侵及漿膜和淋巴道擴散。MMP-3通過降解直腸小細胞癌細胞外基質和基底膜，使癌細胞黏附力減低，使癌腫更容易生長，轉移。這些都提示MMP-3參與的直腸小細胞癌的發展，在腫瘤的侵襲和轉移過程中起重要作用，MMP-3可作為判斷直腸小細胞癌預后的指標。

從Cox-2、nm23和MMP-3蛋白在直腸小細胞癌的表達，說明它們都參與了直腸小細胞癌的局部侵襲和遠處播散，它們是否在直腸小細胞癌的遠處轉移中起協同作用以及相互作用機制還需進一步研究。總之檢測Cox-2、nm23和MMP-3的表達可以判斷直腸小細胞癌患者的預后。

參考文獻

1瓊，羅芳．Cox-2和PTEN在卵巢腫瘤中的表達及臨床意義．中國公共衛生，2012，28: 791-792．

2張帥，沈梁，谷維立，等．VEGF，COX-2在甲狀腺癌中的表達及臨床意義．醫學研究雜志，2012，41: 146-150．

3張漢群，魯亮，張蕓，等．ERCC1、nm23-H1在大腸癌組織中的表達及臨床意義．廣東醫學，2011，32: 2555-2559．

4高艷，張險峰．c-erbB-2，bcl-2和nm23蛋白在結腸癌組織中的表達及意義．黃石理工學院學報，2011，27: 51-54．

5Singh B，Berry JA，Shoher A，et al．COX-2 overexpression increases motility and invasion of breast cancer cells．Int J Oncol，2005，26: 1393-1399．6于秀文，程慧，王靜芬．粘蛋白MUC1，MUC2及基質金屬蛋白酶MMP-3在大腸癌中的聯合表達及臨床意義．醫學研究雜志，2008，37: 23-27．

·論著·

作者單位: 075000河北省張家口市，河北北方學院附屬第一醫院病理科(張劍虹、孫忠哲)，放療科(張飛) ;河北北方學院(張曉麗)

Expression and clinical significance of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum

ZHANG Jianhong*，ZHANG Fei，ZHANG Xiaoli，et al．*Department of Pathology，The First Hospital Affiliated to Hebei North University，Hebei，Zhangjiaku 075000，China

【Abstract】Objective To investigate the correlation between expression of Cox-2，nm23 and MMP-3 in small cell carcinoma of the rectum and clinicopathological characteristics．Methods The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 in 63 cases of small cell carcinoma of rectum were detected by immunohistochemistry and tissue microarray technology．Results The positive expression rates of Cox-2，and MMP-3 were correlated to mesenteric lymph node metastasis and depth of tumor invasion，with the increase of infiltration depth of tumor，lymph node metastasis rate was increased ( P＜0．05)．The positive expression rates of Cox-2 and MMP-3 were not correlated to TNM staging ( P＞0．05)．However positive expression of nm23 protein was related with mesenteric lymph node metastasis and TNM staging ( P＜0．05)，with lymph node metastasis and increase of TNM stage，which was decreased ( P＜0．05)，however，which was not related to infiltration depth of tumor ( P＞0．05)．The expression levels of Cox-2，nm23，MMP-3 were not correlated to patient＇s age and sex ( P＞0．05)．Conclusion The expression levels of Nm23，Cox-2 and MMP-3 in small cell carcinoma of rectum are closely related to clinical prognosis，and combined detection can predict the malignant degree of tumor and can evaluate patient’s prognosis．

【Key words】cyclooxygenase; matrix metalloproteinases; tissue microarray technology; immunohistochemistry; samall cell carcinoma of the rectum

收稿日期:( 2014－07－11)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．005

【中圖分類號】R 735．37

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0497－04