心肌缺血對大鼠腎皮質利鈉肽受體表達的影響

牛麗靜　白云　苗智慧　宋俊貞　管振龍　王燕凌　王惠娟

心肌缺血對大鼠腎皮質利鈉肽受體表達的影響

牛麗靜白云苗智慧宋俊貞管振龍王燕凌王惠娟

【摘要】目的探討大鼠腎皮質利鈉肽受體A( NPR-A)和受體C( NPR-C)的表達在心肌缺血后不同時程的動態變化。方法大鼠分為空白對照組、假手術組和模型組。分別于復制心肌缺血模型后的第3、7、14、18、28天取材，用Western blotting方法檢測腎皮質內NPR-A和NPR-C的表達。結果在上述時間點上，腎皮質NPR-A的表達顯著性降低( P＜0．01)，NPR-C表達呈現由缺血后第3天到缺血后第18天由低到高的波動變化，到缺血后第28天逐漸恢復至空白對照組水平。結論心肌缺血后，動物機體鈉和水的滯留與NPR-A表達的降低以及NPR-C表達的升高密切相關。

【關鍵詞】心肌缺血;利鈉肽受體;腎皮質;蛋白質印跡;大鼠

利鈉肽受體( NPR)主要分為具有鳥苷酸環化酶活性的NPR-A( natriuretic peptide receptors A)、NPR-B ( natriuretic peptide receptors B)以及與抑制性G蛋白偶聯并可以從循環中清除利鈉肽的受體NPR-C( natri-

uretic peptide receptors C)。研究發現，在腎臟集合管上皮細胞基側膜、腎小球以及腎小球膜細胞上分布有利鈉肽受體，利鈉肽在腎功能的調節中起重要作用，通過舒張血管以及利鈉利尿的作用對抗腎素-血管緊張素系統［1］。心肌缺血后腎臟功能受損［2］，即便血漿中存在顯著升高的利鈉肽，但是仍然不能改變機體內鈉和水的滯留現象。由此，作者推測可能心肌缺血后，腎臟組織存在嚴重的利鈉肽功能不足，但目前尚無詳細報道。本實驗以大鼠心肌缺血模型，應用Western blotting技術檢測NPR-A、NPR-C缺血后不同時間點在腎皮質的表達變化，以期找到其在心肌缺血后腎皮質上的時程變化規律，為探究心肌缺血后腎臟功能的變化機制提供基礎資料。

1　材料與方法

1．1材料與試劑健康雄性SD大鼠(體重280～330 g，由河北醫科大學試驗動物中心提供) 60只，購入后在實驗室常溫飼養48 h，適應實驗室環境后用于實驗。兔抗NPR-A多克隆抗體( abcom)、兔抗NPR-C多克隆抗體( abcom)。

1．2實驗分組及模型復制大鼠隨機分為實驗組(模型組，43只)，實驗對照組(假手術組，8只)、空白對照組( 9只)。實驗組大鼠腹腔注射戊巴比妥鈉( 40 mg/kg)麻醉后，在第4～5肋骨間開胸，暴露心臟，用6-0號縫合線迅速結扎心臟的冠狀動脈左前降支復制心肌缺血動物模型［3］。大鼠手術后進行恢復性飼養。將成活的實驗組大鼠隨機分為術后第3天取材組( 9只)，術后第7天取材組( 7只)，術后第14天取材組( 9只)，術后第18天取材組( 9只)和術后第28天取材組( 9只)。假手術組大鼠除了不結扎冠狀動脈左前降支外，其他手術與實驗組的處理相同。空白對照組大鼠不做手術處理，正常飼養。

1．3取材實驗組動物分別在手術后的第3天( 9 只)、7天( 7只)、14天( 9只)、18天( 9只)和28天( 9 只)深度麻醉( 80 mg/kg)，剪開胸腔，暴露心臟，經升主動脈插管，先用100 ml 0．9%氯化鈉溶液沖洗血液。血液沖洗干凈后，迅速摘下心臟，用吸水紙吸干多余水分后稱重;剖開腹腔摘取雙側腎臟，左側腎臟摘下后于冷的0．9%氯化鈉溶液中，用手術刀片縱切剖開腎臟后，迅速剝離腎皮質，用吸水紙吸干多余水分后保存于低溫環境( 0～4℃)，備用(約0．2 g) ;右側腎臟用吸水紙吸干過多水分后稱重。假手術組大鼠、空白對照組大鼠于實驗組術后第3天按上述方法進行取材處理。

1．4TTC染色從上述取材過程中摘下的心臟的心尖部注入1 ml 3%的伊萬氏藍。數秒后將心臟在4℃ 0．9%氯化鈉溶液中沖洗，濾紙吸干水后－20℃保存30 min。隨后把冷凍后的心臟沿房室溝軸橫切成2．0 ～2．5 mm厚的斷面，用0．1%的TTC 0．9%氯化鈉溶液溶液37℃孵育30 min。正常組織被染成紅棕色，梗死區不著色，以此判定心肌缺血模型是否復制成功［4］。

1．5蛋白質印跡分析取大鼠腎臟皮質部分，分別將實驗組、實驗對照組以及空白對照組大鼠( R = 3～4 只)處理并備用的組織混合，低溫下加入RIPA裂解液研磨成漿液，離心后取上清液，考馬斯亮藍蛋白定量。按照蛋白標準曲線測定組織上清液中的蛋白含量，十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(每加樣孔中蛋白上樣量60 μg)之后，將凝膠進行轉膜，并進行NPR-A 和NPR-C的免疫印跡雜交(抗體稀釋濃度為1∶500)以內參肌動蛋白(β-actin)條帶光密度值作為標準，計算NPR-A和NPR-C蛋白的相對表達量。

1．6統計學分析應用SPSS 13．0統計軟件，計量資料以珋x±s表示，進行單因素方差分析，Student Newman-Keuls檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1TTC染色結果模型動物心臟深染成藍色，冠脈結扎創口附近有非常明顯的紅色缺血區和灰白色梗死區。假手術組動物心肌可見少量紅色區域。空白對照組動物心肌組織未見紅色缺血區及白色梗死區域。所有大鼠心肌缺血模型復制成功。見圖1。

2．2心肌缺血后大鼠心臟和腎臟重量的變化大鼠經冠狀動脈左前降支結扎復制心肌缺血模型后，隨時間延長心臟明顯肥大，重量逐漸升高，在術后第14天、18天、28天與空白對照組及假手術組比較差異有統計學意義( P＜0．05)。手術后腎臟的重量，同樣出現隨時間先升高后下降的趨勢，但無統計學意義( P＞0．05)。大鼠心腎重量假手術組與空白對照組均無顯著變化( P＞0．05)。這些指標符合實驗預期的要求。見表1、2，圖2。

表1　大鼠心臟在結扎手術后的平均重量　g，珋x±s

表2　大鼠腎臟在結扎手術后的平均重量　g，珋x±s

2．3腎皮質Western blotting結果對心肌梗死后大鼠腎皮質的Western blotting檢測結果，如圖3所示。以β-actin( 42 kD)作為內參，NPR-A在相對分子量118 kD處有明顯的陽性條帶，NPR-C在相對分子量

65 kD處有明顯的陽性條帶。心肌梗死后NPR-A的表達顯著降低，其中，手術后第7天、18天、28天顯著低于空白對照組( P＜0．01)。NPR-C的表達由手術后3天顯著低于空白對照組( P＜0．01)，而后逐漸升高，到手術后第18天顯著高于空白對照組( P＜0．01)，以及到第28天NPR-C的表達已經恢復到與空白對照組無顯著差異( P＞0．05)。見表3、4，圖3。

圖1　TTC染色結果( A) B的示意圖; ( B)心肌梗死區域被染成亮藍色，心肌缺血區域被染成紅色，非缺血區域被染成灰白色

圖2　大鼠心臟和腎臟在結扎手術后的平均重量( g)

表3腎皮質內NPR-A蛋白表達水平在結扎手術后的平均灰度值

表4　腎皮質內NPR-C蛋白表達水平在結扎手術后的平均灰度值

3　討論

大量的基礎和臨床實驗研究表明，心肌缺血后由于心肌收縮無力，心臟內積存的血液過多，對室壁壓力的增加誘導了利鈉肽大量的分泌，其中腦鈉肽的分泌量與心肌病變的程度呈正相關［5］。所以，臨床上已將血液中腦鈉肽的變化作為評估冠心病的重要指標。心臟分泌的利鈉肽可能通過無血腦屏障的部位入腦，作用于不同的中樞部位，通過影響激素的分泌和交感、副交感神經的活動參與心血管功能的調節［6］。另一方面可以通過抑制腎上腺醛固酮的分泌，降低腎小管細胞的代謝活動，促進排鈉排水，降低血壓和回心血量，減少心臟內的血液積存。

利鈉肽激活細胞膜上的NPR－A或NPR－B對抗交感神經緊張，以及腎素－血管緊張素系統，促進水鈉的排泄［7］。研究發現，大鼠心肌梗塞后，血漿利鈉肽濃度顯著升高［8］，腎素濃度顯著升高，腎臟血流量減少［9］。給正常大鼠灌流利鈉肽，可以顯著降低心輸出量，右心房、左心室末端舒張壓，動脈血壓并增加心率，相對的增加腎臟血流量，增加尿量、尿鈉的分泌，腎小球率過濾等［10］;但給心肌缺血大鼠灌流利鈉肽卻沒有上述腎臟血流動力學的變化［11］。發生心肌梗死的大鼠即便血漿中具有高濃度的利鈉肽，仍然存在機體鈉和水的滯留。心肌缺血后，機體血壓的變化是個復雜的病例生理過程，而腎臟在動脈血壓的長期調控中起重要作用，在腎臟集合管上皮細胞膜基側膜、腎小球以及腎小球膜細胞上分布有利鈉肽受體。

圖3　冠脈結扎后大鼠腎皮質NPR-A和NPR-C的表達變化

本實驗結合前人的實驗結果［12，13］，以SD大鼠為實驗對象，復制心肌缺血模型，觀察腎臟皮質內NPRA和NPR-C在心肌缺血后第3天、7天、14天、18天、28天的表達變化，結果發現，在心肌缺血后的第7天、18天、28天，大鼠腎臟皮質區的NPR-A顯著低于空白對照組( P＜0．01)，腎皮質的NPR-C在心肌缺血后第3天顯著低于空白對照組( P＜0．01)，而后逐漸上升，至心肌缺血后第18天顯著高于空白對照組( P＜0．01)，至缺血后第28天，與空白對照組無顯著差異。NPR-A的顯著降低以及清除劑型受體NPR-C的逐漸

升高顯著的減弱了血漿中高濃度的利鈉肽對出球小動脈以及入球小動脈的舒張作用，從而降低了腎血漿流量和腎小球濾過率，進而抑制了鈉和水的排泄。所以即便給予心肌缺血大鼠灌流利鈉肽，仍然不能改善降低的腎小球濾過率和腎血漿流量［14，15］。Tsunoda等［12］的研究發現，心肌梗死4周后，大鼠腎臟內髓部分利鈉肽結合位點減少1/3。這表明分布于腎髓質集合管上皮細胞基側膜上的利鈉肽受體數量減少，生成的細胞內cGMP含量降低，不能關閉管腔膜上的Na+通道，從而增加了NaCl的重吸收，造成鈉和水的滯留。

本實驗首次細致的研究了心肌缺血后腎臟皮質利鈉肽受體NPR-A和NPR-C的動態表達變化趨勢，提出了心肌缺血后機體水鈉滯留的可能原因。大鼠心肌缺血后，血液中利鈉肽含量顯著升高，血漿腦鈉肽濃度在第3天和第14天有2次升高［16］，即便血漿中存在高濃度的利鈉肽水平，但是腎臟的排鈉排水功能由于利鈉肽功能型受體的顯著降低而受到損害。血漿中升高的利鈉肽通過抑制腎上腺醛固酮的分泌，降低腎小管細胞的代謝活動，促進排鈉排水，降低血壓和回心血量，減少心臟內的血液積存［17］。腎臟利鈉肽受體NPR-A的顯著降低以及NPR-C的波動性升高，可能也只是為了升高血漿中的利鈉肽水平，從而更好的調控心肌缺血后的動脈血壓。心肌缺血后，如何在利鈉肽參與機體血壓調控的同時，又不影響腎臟的排鈉排水功能，將是我們今后的研究重點。

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·論著·

項目來源:河北省醫學科學研究重點課題(編號: 20090044)

作者單位: 050021石家莊市，河北省疾病預防控制中心醫學研究所(牛麗靜、苗智慧、王燕凌、王惠娟) ;河北省唐山職業技術學院基礎醫學部解剖教研室(白云) ;河北省血液中心臨床輸血技術指導辦公室(宋俊貞) ;河北師范大學生命科學學院(管振龍)

Effect of myocardial ischemia on the expression of natriuretic peptide receptor in renal cortex of rats

NIU Lijing*，BAI Yun，MIAO Zhihui*，et al．*Institute of Medicine，Hebei Province Center for Disease Prevention and Control，Shijiazhuang 050021，China

【Abstract】Objective To investigate the changes of the expression levels of natriuretic peptide receptor A ( NPR-A) and C ( NPR-C) in renal cortex after myocardial ischemia ( MI) in rats．Methods All the rats were randomly divided into blank control group，sham-operation group and myocardial ischemia group．After MI models were established，the rats were sacrificed，and the expression levels of NPR-A and NPR-C in renal cortex were detected by Western blotting on day 3，7，14，18，28．Results The expression levels of NPR-A in renal cortex were significantly decreased in different time points mentioned above ( P＜0．01)，however，the expression levels of NPR-C were increased from day 3 to day 18，then，which gradually recovered to the levels in blank control group on day 28．Conclusion After myocardial ischemia，the detention of sodium and water in the kidney of rats is closely correlated to the decrease of expression levels of NPR-A and the increase of expression levels of NPR-C．

【Key words】myocardial ischemia; natriuretic peptide receptor; renal cortex; Western blotting; rats

收稿日期:( 2014－08－18)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．006

【中圖分類號】R 542．2

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0500－04