通心絡膠囊對糖尿病小鼠視網膜p38MAPK信號通路的影響

張哲王超

通心絡膠囊對糖尿病小鼠視網膜p38MAPK信號通路的影響

張哲王超

【摘要】目的觀察通心絡膠囊對糖尿病小鼠視網膜p38絲裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)信號通路的影響，探討其視網膜保護作用的可能機制。方法KK/Upj-Ay小鼠40只隨機分為糖尿病模型組、通心絡低、中、高劑量組，每組10只，另設C57BL/6( C57)小鼠10只作為對照組。按照分組給予不同劑量處理因素，療程3個月，觀察體質量，測定空腹血糖( FBG)，取眼球行HE染色，Western-blot檢測視網膜p38MAPK、JNK、ERK總蛋白及磷酸化p38MAPK、JNK、ERK( p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK)的表達。結果與對照組比較，模型組體質量、FBG及p-p38MAPK、p-JNK、p-ERK表達均顯著增高，通心絡膠囊能夠減輕視網膜病理損傷，降低p-p38MAPK表達( P＜0．05)，而不影響體質量、FBG及p-JNK、p-ERK表達( P＞0．05) ;且各組p38MAPK、JNK、ERK總蛋白表達差異無統計學意義( P＞0．05)。結論p38MAPK信號通路可能參與了糖尿病視網膜損害的發生發展。通心絡膠囊可減輕糖尿病小鼠視網膜病理損傷，其機制可能與降低p38MAPK蛋白磷酸化水平有關。

【關鍵詞】通心絡膠囊;糖尿病;視網膜; p38絲裂原活化蛋白激酶

糖尿病視網膜病變( diabetic retinopathy，DR)是糖尿病常見且嚴重的眼部并發癥，是造成患者失明的主要原因［1］。研究發現，p38絲裂原活化蛋白激酶( p38 mitogen-activated protein kinase，p38MAPK)信號通路的活化參與了糖尿病脂肪、骨骼肌組織的胰島素抵抗，并與糖尿病腎病的發生密切相關［2，3］，但p38MAPK是否參與DR病理過程目前尚不清楚。基礎和臨床研究均證實，通心絡膠囊通過抑制血小板聚集和黏附、保護血管內皮功能等作用減輕DR［4］。本實驗采用自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠為模型，通過觀察通心絡膠囊對p38MAPK信號通路的影響，旨在探討通心絡膠囊對DR的保護作用及其可能機制。

1　材料與方法

1．1材料通心絡膠囊購自石家莊以嶺藥業股份有限公司; p38絲裂原活化蛋白激酶( p38MAPK)、磷酸化p38MAPK ( p-p38MAPK)、c-Jun氨基末端激酶

( JNK)、磷酸化JNK( p-JNK)、細胞外信號調節蛋白激酶( ERK)、磷酸化ERK( p-ERK)一抗購自美國Sigma公司; BCA蛋白檢測試劑盒及ECL化學發光試劑盒購自北京天根公司。

1．2方法

1．2.1實驗動物、分組及給藥:選取12周齡SPF級KK/Upj-Ay和C57BL/6小鼠，雄性，體質量分別為30 ～40 g和25～30 g，購于北京華阜康生物科技股份有限公司，20～25℃常規飼養。按空腹血糖值( FBG)將40只KK/Upj-Ay小鼠分為4組:糖尿病模型組、通心絡膠囊低劑( 1 g生藥/kg)、中劑( 2 g生藥/kg)、高劑( 4 g生藥/kg)組，另設C57BL/6小鼠10只為對照組，對照組和模型組給予等體積蒸餾水，每天1次灌胃給藥，療程3個月。每周測量并記錄各組體質量、FBG。

1．2．2 HE染色:取小鼠眼球，置于甲醛固定，石蠟包埋、切片，HE染色。高倍鏡下觀察視網膜細胞形態結構。

1．2．3Western-blot:取視網膜組織，常規方法提取總蛋白，化學發光法顯色，用UVP軟件檢測并分析蛋白條帶IOD值，β-actin作為內參照，以目的蛋白吸光度值/內參照吸光度值的比值進行定量分析。

1．3統計學分析應用SPSS 10．0統計軟件，計量資料以珋x±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1通心絡膠囊對DR小鼠體重及FBG的影響模型組體重、FBG均較對照組明顯增高( P＜0．01)，通心絡組體重、FBG與模型組比較有下降趨勢，但差異無統計學意義( P＞0．05)。見表1、2。

表1　通心絡膠囊對DR小鼠體重的影響

表2　通心絡膠囊對DR小鼠FBG的影響

2．2通心絡膠囊對DR小鼠視網膜組織病理形態的影響HE染色結果顯示:對照組視網膜組織結構完整，細胞分層清晰，排列緊密整齊;模型組視網膜細胞層明顯變薄，細胞排列紊亂，通心絡中、高劑組細胞形態結構較模型組明顯改善。

2．3通心絡膠囊對DR小鼠視網膜MAPK信號通路的影響Western-blot結果顯示:模型組p38MAPK、JNK、ERK蛋白磷酸化水平均較對照組明顯升高( P ＜0．05或0．01)，通心絡中、高劑組p38MAPK蛋白磷酸化水平較模型組明顯降低( P＜0．05)，JNK和ERK蛋白磷酸化水平與模型組比較差異無統計學意義( P ＞0．05) ; 5組p38MAPK、JNK、ERK總蛋白表達比較差異無統計學意義( P＞0．05)。見表3、圖1。

表3　通心絡膠囊對DR小鼠視網膜MAPK信號通路的影響　n =10，珋x±s

3　討論

DR是糖尿病的嚴重并發癥之一，有關DR的發病機制受到越來越多學者的普遍關注。近年來多項證據表明MAPK信號通路在糖尿病的發生發展中發揮重要調控作用［3］，然而MAPK在DR小鼠視網膜中的研究國內外報道尚少。MAPK是廣泛存在于哺乳動物細胞漿內的絲/蘇氨酸蛋白調節激酶，該通路是介導細胞內外信號傳遞的主要通路，在細胞增殖、分化、凋亡及基因表達過程中發揮著關鍵的調控作用。在MAPK家族中，p38 MAPK、JNK、ERK是其中的主要成員，前兩者可在高糖、氧化應激、炎癥因子等刺激下活化，后者主要調控絲裂原誘導的細胞生長。

圖1　Western-blot檢測p38MAPK、p-p38MAPK、JNK、p-JNK、ERK、p-ERK的表達

近年來，許多動物模型及高糖刺激下的體外細胞模型研究均發現p38 MAPK的磷酸化水平顯著增加。國內外研究顯示，p38 MAPK信號通路的活化是糖尿病神經痛、心肌病、腎病等糖尿病慢性并發癥的共同通路，而磷酸化p38 MAPK( p-p38MAPK)是該通路中發揮關鍵作用的信號分子［3，4］。Lee等［5］研究發現p38 MAPK、晚期糖基化終末產物( RAGE)、白細胞、醛糖還原酶參與了糖尿病導致的視網膜血管功能損傷。Huang等［6］研究了p38 MAPK、JNK、ERK及p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK在2型糖尿病模型小鼠腸系膜動脈內皮細胞中的表達，結果顯示各組間p38 MAPK、JNK、ERK蛋白表達水平無變化，然而p-p38 MAPK、p-JNK表達在糖尿病組明顯升高，p-ERK表達明顯降低，提示磷酸化p38 MAPK、JNK、ERK表達的改變參與了糖尿病導致的血管內皮功能失調。Zhang等［7］研究發現在糖尿病模型組視網膜中p38 MAPK總蛋白表達與正常對照組無明顯差異，但p-p38 MAPK表達水平顯著增高。由此，有理由懷疑p38 MAPK信號通路與DR之間存在某種關聯。本實驗中，我們探討了p38 MAPK信號通路對DR小鼠視網膜功能的影響，Western-blot結果發現: p-p38 MAPK、p-JNK、p-ERK蛋白表達在模型組較對照組明顯增加( P＜0．05)，而p38 MAPK、JNK、ERK總蛋白表達在各組間無顯著變化，提示p38 MAPK信號通路在糖尿病小鼠視網膜組織活化明顯，磷酸化的p38 MAPK、JNK、ERK參與了自發性2型糖尿病KK/Upj-Ay小鼠視網膜病變的發生發展，以上述通路為切入點有可能減輕或改善DR。

通心絡膠囊是包含人參、水蛭、全蝎、蜈蚣、土鱉蟲，蟬蛻、赤芍等成分的中藥復方制劑。基礎和臨床研究均證實，通心絡膠囊具有降脂、降糖、抗凝、改善微循環和胰島素抵抗的作用，其治療糖尿病微血管病變的療效確切。然而通心絡膠囊是否對DR具有保護作用及其可能作用機制尚未完全明確。本研究發現，通心絡中、高劑組能夠明顯降低DR小鼠視網膜病理損傷，改善視網膜病變，從形態學角度證實通心絡膠囊確實具有明顯的DR保護作用，但對體重及FBG無明顯影響。為了進一步探討通心絡膠囊改善糖尿病小鼠視網膜損傷的機制，我們檢測了通心絡干預組p38 MAPK、JNK、ERK在視網膜的表達。我們研究發現通心絡中﹑高劑組干預后p38 MAPK的磷酸化程度明顯下降，而JNK、ERK的磷酸化程度不受影響。長期高糖刺激能夠促進細胞內抗鏈激酶1及其他鏈激酶的激活，后者通過磷酸化p38 MAPK激酶3 ( MKK3)和p38 MAPK激酶6 ( MKK6)導致p38 MAPK三肽區的蘇/酪氨酸被雙磷酸化而激活，活化的p38 MAPK移位進入細胞核后能夠促使NF-κB、AP-1等轉錄因子的核轉位從而導致一氧化氮( NO)、環氧化酶2( COX-2)、內皮素1( ET-1)、黏附分子及自由基的產生增加，通過誘導細胞凋亡和加重炎性反應導致DR的形成和持續發展。因此，通過干預p38 MAPK信號通路中的關鍵信號分子p-p38 MAPK表達就有可能抑制p38 MAPK信號通路的活化。研究顯示，高糖誘導視網膜內皮細胞中氧化應激增加，通過激活內皮細胞VEGF/p38 MAPK通路最終導致細胞凋亡的增加，而鈣拮抗劑和血管緊張素可通過抑制p38 MAPK及抗氧化作用減輕細胞凋亡，從而發揮DR保護作用。我們和他人研究從體內動物模型及體外培養的細胞模型等多個角度證實了磷酸化p38 MAPK的過表達是糖尿病及其并發癥發生發展的關鍵環節，抑制磷酸化p38 MAPK或其下游分子的表達，可為治療DR提供新的思路。芪黃明目膠囊對DR模型小鼠視網膜損傷具有保護作用。芪黃明目膠囊可改善DR模型小鼠視網膜功能，抑制視網膜組織p38 MAPK磷酸化水平，但是，對總p38 MAPK及血糖無明顯影響。本研究結果顯示通心絡膠囊DR保護作用的潛在機制可能與抑制磷酸化p38 MAPK表達及其信號轉導通路有關，與上述研究結果一致。我們和他人研究結果均提示了p38 MAPK作為細胞信號傳遞的共同通路可能是糖尿病慢性并發癥治療的潛在靶點，采用中藥或特異性拮抗劑阻止p38 MAPK信號通路激活或抑制p38 MAPK活性有可能成為改善糖尿病腎病、心肌病及視網膜病變的有效措施，但p38 MAPK介導糖尿病視網膜損傷發生的具體信號機制有待進一步研究。

目前很多研究證實長期高糖狀態下p38 MAPK信號通路可被體內氧化應激等多種刺激激活，后者介導的凋亡信號傳導直接參與DR的發生發展。通心絡膠囊干預后能夠降低磷酸化p38 MAPK的表達，改善視網膜功能，延緩DR進展。本研究雖然為DR的治療和新藥研發提供新思路，但要想徹底治愈這種疾病，我

們還需要從疾病發生的信號通路方面進行更廣泛更深入的研究。

參考文獻

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3Jiao P，Feng B，Li Y，et al．Hepatic ERK activity plays a role in energy metabolism．Mol Cell Endocrinol，2013，375: 157-166．

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5Lee CA，Li G，Patel MD，et al．Diabetes-induced impairment in visual function in mice: contributions of p38 MAPK，RAGE，leukocytes，and aldose reductase．Invest Ophthalmol Vis Sci，2013，56: 271-277．

6Huang A，Yang YM，Yan C，et al．Altered MAPK signaling in progressive deterioration of endothelial function in diabetic mice．Diabetes，2012，61: 3181-3188．

7Zhang X，Lai D，Bao S，et al．Triamcinolone acetonide inhibits p38MAPK activation and neuronal apoptosis in early diabetic retinopathy．Curr Mol Med，2013，13: 946-958．

·論著·

項目來源:河北省自然科學基金項目(編號: C2011307008)

作者單位: 050051石家莊市，河北省人民醫院省老年醫學重點實驗室

Effects of Tongxinluo capsule on p38 mitogen-activated protein kinase signal pathway in retina of diabetic mice

ZHANG Zhe，WANG Chao．Key Laboratory of Geriatric Medicine，Hebei Provincial People’s Hospital，Shijiazhuang 050051，China

【Abstract】Objective To observe the effects of Tongxinluo capsule on p38 mitogen-activated protein kinase ( p38MAPK) signal pathway in retina of diabetic mice in order to explore the possible mechanism of the protective effect of Tongxinluo capsule on retina．Methods Forty KK/Upj-Ay mice were randomly divided into diabetes model group，diabetic model with Tongxinluo ( low-dose，median-dose，high-dose) groups，with 10 mice in each group，at the same time，10 C57BL/6 mice were selected as control group．After 3 months，the mice were sacrificed and were weighed．The fasting blood glucose ( FBG) was measured．The retina was subjected to HE staining．The expression levels of total p38MAPK，phosphorylated p38MAPK( p-p38MAPK)，total JNK，phosphorylated JNK( p-JNK)，total ERK，phosphorylated ERK( p-ERK) in retina were detected by Western blotting．Results As compared with those in control group，the average body mass and the expression levels of p-p38MAPK，p-JNK，p-ERK were significantly increased in model group．Tongxinluo capsule could relieve retinal pathological damage and reduce the expression levels of p-p38MAPK in retina of diabetic mice ( P＜0．05)，however，which had no effect on body weight，FBG and expression levels of p-JNK，p-ERK( P＞0．05)．Furthermore，there were no significant differences in the expression levels of p38MAPK，JNK and ERK proteins among groups ( P＞0．05)．Conclusion The p38MAPK signal pathway may be involved in the pathogenesis and development of diabetic retina injury．Tongxinluo capsule can relieve retina pathological damage in diabetic mice，which may be related with down-regulating phosphorylation of p38MAPK protein．

【Key words】Tongxinluo capsule; diabetes mellitus; retina; p38 mitogen-activated protein kinase

收稿日期:( 2014－09－03)

通訊作者:王超，050051河北省人民醫院省老年醫學重點實驗室;E-mail: 13731156811@163．com

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．007

【中圖分類號】R 587．26

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0504－04