新輔助放化療前后低位直腸癌癌旁組織TRAIL的表達情況

王雪平　戴光耀　馬亮亮　羅玉賢　赫建平　顧福杭

新輔助放化療前后低位直腸癌癌旁組織TRAIL的表達情況

王雪平戴光耀馬亮亮羅玉賢赫建平顧福杭

【摘要】目的研究腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體( TNF-related apoptosis-inducing ligand，TRAIL)在低位直腸癌癌旁組織新輔助放化療前后的表達情況。方法選取2011年6月至2013年10月低位直腸癌患者60例，分別于放化療前活檢及放化療手術后取材癌旁組織，利用免疫組織化學SP法分別檢測放化療前后TRAIL的表達情況。結果新輔助放化療后TRAIL在癌旁組織的陽性表達率較放化療前升高40%，差異有統計學意義( P＜0．05)。結論TRAIL的表達情況與腫瘤的分期密切相關(經放化療后腫瘤降期)，提示通過檢測患者癌旁組織的TRAIL的表達，或有助于判斷腫瘤患者的預后。

【關鍵詞】TRAIL;低位直腸癌;新輔助放化療; TNM分期

作者單位: 050011河北省石家莊市第一醫院

TRAIL即腫瘤壞死因子相關凋亡誘導配體。最早由Wiley等［1］在1995年及1996年Pitti等［2］克隆出來并被逐漸認知。TRAIL屬TNF超家族成員，TRAIL通過觸發caspase級聯反應，最終導致程序性細胞凋亡［3］。TRAIL廣泛表達于正常人的各種組織，在各種消化道腫瘤中則會出現表達缺失或低表達。如胰腺癌［4］、結直腸癌等。TRAIL作為抑癌基因在直腸正常組織中高表達，而在直腸癌癌旁組織及癌組織中則依次遞減，大量試驗證明了TRAIL可作為臨床新的敏感免疫組化參考指標［1－3］，新輔助放化療的引入，降低了直腸癌局部復發率，同時提高了保肛率，增加了患者的生存時間。新輔助放化療前后TRAIL在低位直腸癌癌旁組織中的表達情況筆者尚未見國見報道，本文就我院相關研究報告如下。

1　資料與方法

1．1一般資料選取我院2011年6月至2013年10月低位直腸癌患者60例，其中男33例，女27例;年齡19～80歲，平均年齡58．5歲。患者入組前身體狀況整體評估可行新輔助放化療，活檢病理限定為T3期中分化腺癌，同時滿足影像及腔內超聲雙重檢查均提示無遠處臟器轉移之條件，分別于同步放化療前后取材癌旁組織(指距病灶2 cm的組織)，并分別檢測放化療前后癌旁組織中TRAIL的表達水平。

1．2標本制備及主要試劑活檢組織離體后用蒸餾水立刻清洗迅速取材。取材后即刻固定于10%中性甲醛溶液中。鼠抗人TRAIL抗體購于美國Santa Cruz公司;鼠及兔SPN免疫組化試劑盒、DAB試劑盒購于中國中山公司。

1．3方法

1．3．1免疫組化SP法: TRAIL出現概率:細胞漿明顯小于細胞核，TRAIL陽性是細胞漿和細胞核內出現棕黃色顆粒。參照Wiley等［1，5］的方法進行全面評估，即包括染色強度和染色范圍，即在每個視野中，計數要超過500個細胞并對細胞染色的強度進行半定量分析。采用奧林巴斯顯微鏡40×50觀察組織圖像，并通過攝像頭和數字化的軟件對產生免疫反應的組織總面積進行定量分析，通過反應的程度(范圍)和強度計算，最終以染色強度及范圍的乘積確定得分; TRAIL的陽性率，染色程度即TRAIL陽性染色所百分率。TRAIL陽性參照則采用已知陽性切片，陰性參照則以PBS替換一抗。抗體濃度TRAIL為1∶50，以PBS溶液代替一抗做空白對照，操作按照試劑盒說明逐步進行。

1．3．2放療:患者于模擬定位機以俯臥位定位，直腸內沖入造影劑80～120 ml，顯影后觀察直腸以上腸段有無癌瘤發生，首先確定各邊界范圍。野前緣達膀胱后壁，野后緣達骨外0．5 cm，后野達骨盆外1．0 cm，下界達會陰，上界達骶1，放療劑量45 Gy/20～25次，縮野時追加10～15 Gy。放療時間一般為5周左右。期間考慮放療的不良反應，根據副作用的強度決定放療的具體時間。如果期間有空白放療期則順延放療時間。

1．3．3化療:根據NCCN指南，每日據體表面積計算用藥劑量，口服卡培他濱1 250 mg/m2，2次/d，7周左右。根據服藥后的藥物耐受情況隨時調整卡培他濱片(希羅達)的劑量。如出現劇烈惡心、頑固腹瀉等情況則對癥治療無效時減少藥物劑量，

此次試驗中未發生因各種原因而中途離組情況，

僅有少量患者出現輕度放化療不良反應，經積極對癥治療后順利完成放化療，期間未介入其他治療，如生物治療、中醫藥治療等。

1．4結果判定免疫組化根據染色反應的深度及陽性細胞的數量分別記分為0～3分，其中染色深度以多數細胞的呈色反應為準。淺黃色為1分，棕黃色為2分，棕褐色為3分，不著色為0分。陽性細胞數＜10% 為0分，10%～45%為1分，46%～70%為2分，＞70%為3分，并根據這兩項指標的積分數分為4級，即陰性(－)為0分，弱陽性( + )為2分，陽性( + + )為3～4分，強陽性( + + + )為5～6分。

1．5統計學分析應用SPSS 11．5統計軟件，計量資料以珋x±s表示，采用t檢驗，P＜0．05為差異有統計學意義。

2　結果

2．1新輔助放化療后TRAIL在癌旁組織的表達率比較放化療前TRAIL陽性率20% ( 12/60)，放化療后TRAIL陽性率60%( 36/36)，較放化療前升高40%( P ＜0．05)。

2．2免疫組化各組組織化學評分分級及例數見表2。

表2　TRAIL表達情況參數分級　n =60，例

2．3放化療前后TRAIL組化染色見圖1。

圖1　TRAIL在直腸癌旁組織放化療前后的活檢表達情況(免疫組化×2000)

3　討論

直腸癌包括于大腸癌之中，目前大腸癌的患病率及死亡率全球每年2%的速度上升，直腸惡性腫瘤的出現是多環節、多因素的復雜過程。大量研究匯總分析提示，電子結直腸鏡下腺瘤至癌就需要五年左右的時間［6］。早期癌多數情況下是可以達到臨床治愈的，而早期直腸癌可無明顯的臨床癥狀。傳統的影像檢測有局限性如輻射，癌灶小時則易漏診，腸鏡則較為痛苦，且需要腸道準備，多有不便。因此臨床需要一種較為敏感的檢測指標，同時又簡便易行。研究顯示TRAIL在直腸癌、癌旁組織及正常直腸黏膜組織中呈遞增的表達趨勢，提示直腸癌的發生發展過程中存在TRAIL的缺失，TRAIL能作用各種腫瘤細胞，可明顯誘導腫瘤細胞的凋亡，與此同時，其對正常細胞則未發現有細胞毒性，其不依賴于p53的誘導凋亡模式，也迥異于放化療所導致的腫瘤細胞的凋亡，因此其制劑對化療耐藥的癌瘤亦是有其特定的臨床應用的可行性。TRAIL的免疫組織化學SP法研究廣泛而徹底，臨床驗證其可靠性高，并且較為敏感，可以作為直腸癌檢測的靈敏指標。

新輔助放化療作為降低腫瘤分期的有效方法，在臨床上應用廣泛，其能增加腫瘤手術切除的機率，尤其是直腸癌局部放療能明顯降低局部的復發率。但有研究顯示單純的新輔助放療并不能有效提高生存率。

NCCN指南中系統闡述了術前放化療(新輔助放化療)的積極意義［7］，關于新輔助放化療的研究驗證了其臨床獲益性［6－8］，值得一提的是目前關于TRAIL制劑聯合放化療的治療新模式也被提出，Nagane等［9］試驗證實了化療聯合TRAIL降低了耐藥性，顯示了二者聯合應用的優勢及臨床價值，Marini等［10］研究得出，放療所致的電離輻射可使多種消化道、腺體等的癌細胞對TRAIL顯示更高的敏感性。關鋒等［11］則具體就腫瘤壞死因子與單純放療進行了系統的研究。TRAIL聯合放療也是一新的診療模式。

本文針對低位直腸癌進行了TRAIL與新輔助放化療相關的臨床研究，通過新輔助放化療前后檢測癌旁組織中TRAIL的表達情況，新輔助放化療提高了其陽性表達率，但弱陽性者居多，考慮短期內基因活化不足，可能存在放化療對于細胞活性及功能的影響，同時放化療后出現的放射性皮炎及膀胱炎、腸道功能紊亂、性功能障礙，化療性靜脈炎，化療產生的全身不適如酸痛、惡心、腹瀉等諸多不良反應，糖尿病［12］、激素紊亂等體質因素等。使部分患者不能堅持規律治療也影響結果判定，因此需進一步深入研究其機制。以期發現新輔助放化療與抑癌基因生物治療的契合點。

參考文獻

1Wiley SR，Schooley K，Smolak PJ，et al．Identification and characterization of a new member of the TNF family that induces apoptosis．Immunity，1995，3: 673-682．

2Pitti RM，Marsters SA，Ruppert S，et al．Induction of apoptosis by Apo-2 ligand，a new member of the tumor necrosis factor cytokine family．J Boil Chem，1996，271: 12687-12690．

3Playing the DISC: Turning on TRAIL death receptor-mediated apoptosis in cancer，Bodva l Pennarun，Annemieke Meijer，Elisabeth G．E．de Vries，Biochimica et Biophysica Acta ( BBA)．Reviews on Cance，2010，182: 123-140．

4Dominic S，Andrea M，Caroline R．TRAIL-Induced Apoptosis Is Preferentially Mediated via TRAIL Receptor 1 in Pancreatic Carcinoma Cells and Profoundly Enhanced by XIAP Inhibitors．Clin Cancer Res December，

2010，16: 5734-5749．

5Engelen SM，Beets-Tan RG，Lahaye MJ，et al．MRI after chemoradiotherapy of rectal cancer: a useful tool to select patients for local excision．Dis Colon Rectum，2010，53: 979-986．

6Twu CM，Wang HM，Chen JB，et al．Neoadjuvant concurrent chemoradiotherapy in treating locally advanced rectalcancer．J Chin Med Assoc，2009，72 : 179-182．

7Clinical practice guidelines of rectal cancer 2011vll．Available at http: / / www．nccn．org/professionals/physician_gls/PDF/rectal．pdf．

8Gérard JP，Azria D，Gourgou-Bourgade S，et al．Comparison of two neoadjuvant chemoradiotherapy regimens for locally advancedrectal cancer: results of the phaseⅢtrial ACCORD 12/0405Prodige 2．J Clin Oncol，2010，28: 1638-1644．

9Nagane M，Pan GH，Weddle JJ，et al．Increased death receptor 5 expression by chemotherapeutic agentsin human gliomas causes synergistic cytotoxicity with tumor necrosis factor related apoptosis—inducing ligandin vitro and in vivo E．Cancer Res，2000，60: 847-853．

10Marini P，Schmid A，Jendrossek V，et al．Irradiation specifically sensitizes solid tumour cell lines to TRAILm ediated apoptosis．BMc Cancer，2005，5: 5．

11關鋒，龔平生，王志成，等．腫瘤壞死因子相關凋亡配體在腫瘤放射治療中的作用．中華放射醫學與防護雜志，2014，34: 231-234．

12宋春法，王貴英．腹腔鏡與開腹結直腸癌合并2型糖尿病患者術后炎癥的對比分析．河北醫科大學學報，2013，34: 1384-1386．

·論著·

收稿日期:( 2013－12－30)

doi:10．3969/j．issn．1002－7386．2015．04．014

【中圖分類號】R 735．37

【文獻標識碼】A

【文章編號】1002－7386( 2015) 04－0522－03