烏司他丁對中暑大鼠腎損傷及氧化應激的影響

彭娜，耿焱，張爽，唐柚青，文強，劉云松，蘇磊

中暑以高熱和神經系統功能紊亂為主要特征，可發展為重癥中暑(severe heat stroke，SHS)，導致多臟器功能衰竭，甚至死亡。腎損傷是重癥中暑常見的并發癥，可導致住院時間延長、死亡發生率增加。研究表明，中暑時的多種病理生理因素可導致臟器功能損傷，包括炎癥反應、內皮損傷、缺血缺氧、凝血障礙等[1]。烏司他丁(UTI)是一種胰蛋白酶抑制劑，具有抑制蛋白酶活性和炎癥因子過度釋放、清除氧自由基等作用，對多種因素導致的臟器功能損害具有保護作用[2-6]。本研究從氧化應激的角度初步探討了SHS導致腎損害的機制，并進一步觀察烏司他丁對中暑氧化應激和腎損傷的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗動物及分組 雄性SPF級Wistar大鼠42只，體重220～250g，由廣州軍區廣州總醫院動物中心提供，實驗動物的相關方案通過動物倫理委員會批準。大鼠隨機分為對照組(n=6)、中暑組(HS組，n=18)及烏司他丁治療組(UTI組，n=18)。對照組置于23.0±0.2℃室溫下飼養，其他兩組復制中暑模型[7]。UTI組于制模前腹腔注射UTI 10萬U/kg，每12h重復給藥，其余兩組大鼠均注射等量生理鹽水。模型復制成功后，迅速轉移至與對照組相同環境下復溫，自由進食水。

1.2 SHS模型復制 將HS組大鼠置于仿真高溫氣候艙內(4m×3m×2m，由南方醫科大學公共衛生熱帶醫學院提供)，艙內溫度39.5±0.2℃，濕度60%±5%。分別采用直腸熱電偶(BW-TH 1101，Biow ill，上海)置入大鼠直腸深度約6.5cm處監測核心體溫，經鼠尾無創血壓監測系統(Biowill，上海)行無創血壓監測，每次10m in。以大鼠收縮壓自峰值開始下降作為中暑標志[8-9]。

1.3 標本采集及處理 對照組于造模前麻醉處死，HS組及UTI組大鼠于造模0、6、24h分批予5%水合氯醛(0.2m l/100g)麻醉，經心臟采血約3m l。3000r/min離心分離血漿，–20℃低溫保存待檢。取一側腎臟組織立即置于–80℃保存以制備組織勻漿，另一側腎臟留取標本行組織學檢查。以最快的速度留取腎臟組織標本2.5mm3大小，以4%多聚甲醛固定，石蠟包埋切片，行HE染色及光鏡檢查。取4～5塊1mm3大小的一側腎皮質區組織，置于專用固定液中，4℃冰箱保存，制作電鏡切片并觀察腎小管細胞的超微改變。

1.4 指標檢測及評分標準

1.4.1 血清腎功能指標檢測 采用全自動生化分析儀(Hitachi 7600，日本日立公司)檢測血清肌酐(Cr)、尿素氮(BUN)水平，按說明書步驟進行操作。

1.4.2 腎臟組織氧化應激指標檢測 采用南京建成生物工程研究所提供的試劑盒檢測大鼠腎臟組織氧化應激指標。以還原型谷胱甘肽法測定谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)活性，硫代巴比妥酸(TBA)反應法測定丙二醛(MDA)含量，黃嘌呤氧化酶法測定超氧化物歧化酶(SOD)活性。

1.4.3 腎損傷組織學評分 采用Paller法進行腎損傷組織學評分。每只大鼠在400倍光鏡下隨機選10個視野觀察，每組60個視野，評分標準包括：腎小管明顯擴張，細胞扁平為1分；刷狀緣損傷為1分，脫落為2分；細胞質空泡1分；間質水腫1分；腎小管腔內有脫落的壞死細胞未形成管型或碎片為1分，形成管型或碎片為2分。

1.5 統計學處理 采用SPSS 17.0軟件進行統計分析，計量資料以表示，多組間比較采用方差分析，進一步兩兩比較采用Bonferroni法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 各組大鼠腎功能指標變化 與對照組比較，中暑后6h，HS組和UTI組大鼠血清BUN和Cr均明顯升高(P＜0.05)，24h達到峰值，但UTI組升高的程度較同時間點HS組明顯減輕(P＜0.05，表1)。

2.2 大鼠腎組織氧化應激指標變化 與對照組比較，HS組及UTI組大鼠腎組織MDA水平于模型復制成功后0h明顯升高(P＜0.05)，6h及24h有所下降，但仍明顯高于對照組(P＜0.05)，而UTI組各時間點MDA水平升高程度較HS組明顯減輕(P＜0.05)。HS組大鼠腎組織SOD和GPx活性于模型復制后6h明顯低于對照組和UTI組(P＜0.05)，而UTI組與對照組比較無明顯下降(P＞0.05，表1)。

2.3 大鼠腎組織病理檢查及損傷評分比較 光鏡下，中暑后24h中暑大鼠腎臟表現為中性粒細胞浸潤、腎小管腫脹壞死及蛋白樣物質沉積，與HS組比較，UT I組上述表現明顯減輕。電鏡下，HS組腎小管線粒體廣泛空泡化，UTI組腎小管線粒體部分空泡化(圖1)。Paller評分顯示，與對照組(13.21±4.06)比較，HS組及UTI組大鼠腎損傷Paller評分明顯升高(分別為82.31±10.43、193.23±6.58)，差異均有統計學意義(P＜0.05)。

表1 各組大鼠血清Cr、BUN及腎組織氧化應激指標的變化(±s，n=6)Tab.1 Changes of serum Cr and BUN and oxidative stress indicators of kidney tissues in the rats of different groups (±s, n=6)

表1 各組大鼠血清Cr、BUN及腎組織氧化應激指標的變化(±s，n=6)Tab.1 Changes of serum Cr and BUN and oxidative stress indicators of kidney tissues in the rats of different groups (±s, n=6)

(1)P＜0.05 compared with control group; (2)P＜0. 05 compared with HS group

Group BUN(mmol/L) Cr(μmol/L) MDA(nmol/mg) SOD(U/mg) GPx(U/mg)Control group 5.80±0.26 39.00±3.21 1.35±0.27 0.35±0.12 0.28±0.05 HS group 0h 11.10±0.35 73.00±7.61 6.28±0.53(1) 0.36±0.09 0.29±0.04 6h 18.60±2.06(1) 89.00±14.59(1) 4.31±0.42(1) 0.23±0.05(1) 0.19±0.02(1)24h 26.30±4.02(1) 118.00±12.36(1) 3.25±0.19(1) 0.18±0.04(1) 0.15±0.04(1)UTI group 0h 7.30±0.24 54.00±6.78 5.03±0.49(1)(2) 0.30±0.11 0.27±0.03 6h 12.30±2.37(1)(2) 65.00±12.41(1)(2) 3.13±0.33(1)(2) 0.36±0.11(2) 0.26±0.03(2)24h 16.20±3.69(1)(2) 79.00±11.58(1)(2) 2.03±0.45(1)(2) 0.30±0.03(2) 0.25±0.03(2)

圖1 各組大鼠腎臟組織病理改變Fig.1 Renal histopathological change of rats in control group, HS group and UTI group A. Electron m icroscopy (×30 000); B. Light m icroscopy (×400)

3 討 論

SHS常導致多臟器功能損傷，腎臟是其中最常見的損傷臟器之一。因病情嚴重程度的不同，SHS臨床表現不一，輕者出現蛋白尿、血尿，重者可出現腎衰竭，導致病程延長及預后不良。本研究在復制大鼠SHS模型的基礎上，觀察早期腎臟功能和組織病理的動態改變。結果表明，在SHS早期，大鼠即出現進行性腎功能損害，病理損傷表現為中性粒細胞浸潤、組織間隙充血水腫、腎小管壞死及蛋白管型。上述變化與既往文獻報道基本一致[10]。

氧化應激是機體正常的氧化和抗氧化失衡所致，是氧自由基蓄積而產生的損傷，包括細胞微分子的氧化修飾、細胞結構損傷和器官損傷[11]等。氧化應激與人類多種疾病的發生、發展密切相關[12]。文獻報道，氧自由基及其衍生產物參與了膿毒癥的發生和發展，是導致膿毒癥臟器功能損害的重要機制[13]。在合并急性腎衰竭的危重病患者中，氧化應激水平亦顯著升高[14]。

中暑被認為是較膿毒癥更為劇烈的失控性炎癥反應，其激活的中性粒細胞和巨噬細胞甚至內皮細胞均可產生大量的氧自由基[15]。已有大量研究關注熱應激下氧自由基與臟器損傷的關系。體外及體內實驗顯示，熱應激可導致小腸活性氧及MDA等氧化應激產物含量升高，并伴隨著促凋亡p38MAPK途徑的激活[16]。本研究重點對腎臟氧化應激及損傷狀況進行分析，結果顯示SHS大鼠腎組織MDA含量于造模后0h開始明顯升高，SOD和GPx活性于造模后6h明顯下降，24h較前有所恢復，但與對照組比較差異仍有統計學意義，同時腎功能隨病情發展而加重，且伴病理結構的損害。MDA是體內多不飽和脂肪酸過氧化變性的終產物，代表了整體脂質的氧化水平。SOD和GPx是機體重要的抗氧化酶，結合MDA水平，可以反映機體的氧化應激狀況。本實驗結果表明，SHS時氧化應激可能是急性腎臟損傷的病理生理機制之一。

UTI是從健康男性尿液中提取的尿胰蛋白酶抑制劑[17-18]，大量研究證實其具有穩定溶酶體膜、減少炎癥介質釋放的作用[19-21]。Ito等[22]報道UTI可以降低急性肺損傷小鼠肺組織髓過氧化物酶水平，從而改善肺水腫和肺出血癥狀。Tanaka等[23]報道，UTI可減少內毒素血癥大鼠氧自由基的產生，其機制可能與UTI抑制了還原型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)的作用有關。基于上述研究，本研究進一步觀察了UTI對SHS大鼠腎臟氧化應激及損傷的影響，結果顯示UTI治療組大鼠腎臟MDA含量較HS組明顯下降，SOD和GPx活性則明顯升高，表明UTI可以減輕腎臟的氧化應激水平，從而保護腎功能。

綜上所述，本研究在SHS大鼠模型基礎上觀察了UTI對腎臟氧化應激及腎損傷的影響，結果顯示UTI可以降低SHS大鼠腎臟MDA的含量，抑制SOD和GPx活性的下降，從而減輕腎臟的氧化應激水平，同時腎臟的病理損傷和腎功能指標得到改善。因此，UTI可能是早期治療SHS腎臟損傷的有效藥物，進一步的機制及劑效關系研究可為其臨床應用提供更多理論依據。

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