慢性淺表性胃炎不同證型大鼠琥珀酸脫氫酶活性與細胞色素C含量對比研究

王麗　李翌萌

慢性淺表性胃炎不同證型大鼠琥珀酸脫氫酶活性與細胞色素C含量對比研究

王麗李翌萌

【摘要】目的探討慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)脾虛與濕熱證模型大鼠胃組織琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogenase,SDH)的活性及細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)的含量變化，從能量代謝的角度揭示CSG不同證候的實質。方法用水楊酸鈉溶液灌胃法復制大鼠單純CSG模型，在此基礎上，用小承氣湯瀉下法及饑飽失常法復制脾虛CSG模型；用肥甘辛辣飲食法復制濕熱CSG模型，5周后，檢測大鼠胃組織琥珀酸脫氫酶活性及細胞色素C含量。結果SDH的含量為：濕熱CSG組最高，而脾虛CSG組最低。脾虛CSG組與濕熱CSG組分別與其他組比較，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；胞漿中Cyt-C含量造模組均高于正常組，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)，其中脾虛CSG組最高，濕熱CSG組次之，兩組之間比較，差異有統計學意義(P<0.01)。結論CSG不同證型大鼠胃組織SDH活性及Cyt-C含量的差異，提示同一疾病不同證型之間能量代謝狀態的不同，濕熱證相對于脾虛證能量代謝較亢進。

【關鍵詞】濕熱證；脾虛證；琥珀酸脫氫酶；細胞色素C；慢性淺表性胃炎

慢性淺表性胃炎(chronic superficial gastritis, CSG)為消化系統的一種常見病，指胃黏膜呈慢性淺表性炎癥改變。有研究[1]發現，脾虛證和濕熱證是其較多見的證型。琥珀酸脫氫酶(succinate dehydrogen-ase,SDH)是三羧酸循環中的一個重要的酶，在生物體內，能催化琥珀酸脫氫轉變成延胡索酸，同時釋放出大量能量供機體利用。相關研究[2]得出結論，SDH活性高低與細胞有氧代謝呈正相關。細胞色素C(cytochrome C,Cyt-C)是線粒體呼吸鏈中傳遞電子的載體，研究[3]指出，如果Cyt-C功能障礙，則會引起線粒體呼吸鏈功能異常，導致ATP缺失，出現細胞死亡。本研究通過復制慢性淺表性胃炎大鼠脾虛證和濕熱證模型，檢測大鼠胃組織SDH活性及胞漿中細胞色素C的含量，以期從能量代謝的角度探討CSG脾虛證及濕熱證的實質。

1材料和方法

1.1實驗動物

40只清潔級SD大鼠[合格證號：SCXK(京)2007-0001]，體質量(170±20)g，雌雄各半。

1.2分組與造模

參考文獻[4-6]進行造模。40只大鼠用隨機數字表法選出10只，每天灌胃2 mL生理鹽水，持續5周，此為正常對照組；另30只每天灌胃5%水楊酸鈉溶液10 mL/kg·d，3周后，用隨機數字表法將其平均分為以下三組：單純CSG組、脾虛CSG組和濕熱CSG組。此三組繼續按體重灌胃5%水楊酸鈉溶液，在此基礎上，脾虛CSG組另予小承氣湯10 mL/kg·d灌胃，隔日半量飲食，自由飲水；濕熱CSG組大鼠可自由飲用200 g/L的蜂蜜水，隔日交替灌服10 mL/kg·d的白酒與油脂；而單純CSG組不加其他因素，2周后，造模結束。此造模過程共持續5周，3只大鼠由于灌胃不慎等原因死亡。

1.3主要試劑

SDH試劑盒(批號：20101207)、考馬斯亮藍蛋白測定試劑盒(批號：20101207)、大鼠Cyt-C定量檢測試劑盒(批號：20101207)，均購自南京建成生物工程研究所。

1.4主要儀器

anthos 2010全自動酶標儀(奧地利安圖公司)，TU-1810紫外可見分光光度計(北京普析通用儀器有限公司)；勻漿器；BX51 Olympus 熒光顯微鏡(日本奧林巴斯公司)；TGL-20M高速臺式冷凍離心機(長沙湘儀離心機儀器有限公司)；精密移液器；SHA-B恒溫振蕩器(常州國華電器有限公司)；

1.5指標檢測

1.5.1琥珀酸脫氫酶(SDH)檢測大鼠處死后剖開腹腔，稱量一定量的胃組織，加9倍生理鹽水，制成10%的勻漿，2500 r/min離心10分鐘后，按試劑盒說明方法取上清液進行SDH活性檢測。

1.5.2細胞色素C(Cyt-C)檢測將準確稱量的胃組織按重量體積比加入4倍的生理鹽水，制成20%的勻漿，2500 r/min離心10 分鐘后棄沉淀, 取上清液，再以10000 r/min低溫離心15 分鐘, 取上清液，上清液為胞漿，采用雙抗體兩步法夾心酶聯免疫吸附法(ELISA)進行Cyt-C含量的測定。

1.6統計學分析

2結果

2.1大鼠胃組織SDH活性變化比較

大鼠胃組織SDH活性比較：濕熱CSG組最高，而脾虛CSG組最低。各組數值經Levene檢驗方差齊，說明組間有差異，用LSD法進行組間比較，得出以下結果：脾虛CSG組分別與其它三組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；濕熱CSG組分別與其他三組比較，差異均有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；正常組與單純CSG組比較，差異未有統計學意義(P>0.05)，見表1。

組別nSDH(U/mgprot)Cyt-C(nmol/L)正常組102.24±0.50ac62.57±7.01c單純CSG組101.84±0.22bc71.87±5.9cd濕熱CSG組82.84±0.48c74.93±8.97ce脾虛CSG組91.12±0.56b86.43±3.58

注：與濕熱CSG組比較，aP<0.05，bP<0.01；與脾虛CSG組比較，cP<0.01；與正常組比較，dP<0.05，eP<0.01

2.2各組大鼠胃組織Cyt-C含量變化比較

大鼠胃組織胞漿中Cyt-C含量比較：造模三組均高于正常對照組。其中，濕熱CSG組最高，脾虛CSG組次之，各組經Levene檢驗方差齊，說明總體有差異，采用LSD法進行多組間比較，得出以下結果：脾虛CSG組分別與其他三組比較，差異均有統計學意義(P<0.01)；正常組分別與單純CSG組及濕熱CSG組比較，差異有統計學意義(P<0.05或P<0.01)；濕熱CSG組與單純CSG組比較，差異未有統計學意義(P>0.05)，見表1。

3討論

SDH是線粒體內膜的結合酶，為線粒體的一種標志酶，可為真核細胞線粒體和多種原核細胞需氧和產能的呼吸鏈提供電子，SDH的活性增高，標志著細胞內能量即ATP生成增強[7]。

實驗中濕熱CSG組大鼠胃組織SDH活性增強，提示機體能量生成增加，究其原因有可能與熱證時細胞線粒體氧化磷酸化功能亢進有關。有研究[8]通過復制大鼠實熱證、虛熱證模型，發現肝細胞線粒體呼吸鏈SDH活力升高，后經清熱中藥干預2周后，SDH活力有所恢復，提示熱證與機體能量代謝的正相關性。

實驗中脾虛CSG組大鼠胃組織SDH活性明顯低于其他三組，其活性下降原因可能因為機體處于正氣不足的虛證狀態，組織細胞代謝低下，而SDH活性亦隨著線粒體功能下降而降低。相關研究[9]用大黃復制大鼠脾虛模型，發現SDH含量明顯降低，與本研究結果相一致。

Cyt-C是生物氧化呼吸鏈中重要的電子傳遞體，供應細胞能量。正常情況下，位于線粒體內、外膜之間，不能透過外膜。但當組織缺氧等致細胞膜通透性增高時，細胞色素C可以穿過外膜[10]，進入到胞漿中。亦有研究[11]表明在長期脾虛狀態下，各器官線粒體DNA受到損害，機體能量代謝相應減少。通過本研究可知：脾虛組大鼠的胃細胞胞漿內Cyt-C含量最高，由此推測可能是由于脾虛，正氣不足，線粒體呼吸鏈功能異常，ATP缺乏，能量產生不足，細胞功能下降，導致細胞膜通透性相對增高，Cyt-C透過線粒體外膜進入胞漿，出現胞漿內Cyt-C含量增高的變化。

本研究顯示濕熱CSG組大鼠Cyt-C含量高于正常組，差異有統計學意義；但不及脾虛CSG組(P<0.01)，與單純CSG組比較差異未有統計學意義(P>0.05)，關于濕熱證大鼠細胞色素C活性研究的相關報道較少，尚未查到，其作用機制尚待進一步探討，亦不排除本研究由于樣本含量、造模方法、實驗手段、操作流程等出現的偏倚所致。

相關研究[6]指出，大鼠脾虛狀態下肝臟線粒體琥珀酸脫氫酶、細胞色素氧化酶活性均顯著降低，說明線粒體受損，能量代謝出現障礙。本研究亦發現，SDH活性及Cyt-C含量在濕熱CSG組及脾虛CSG組大鼠中存在差異，由此可推斷病同證不同，則其分子生物學指標出現差異，這可能是證在微觀指標上的體現。關于細胞色素C的釋放途徑、發生機制等，尚待進一步探討。

[1]謝淑穎,周曉虹.慢性胃炎的中醫常見證型研究[J].遼寧中醫藥大學學報,2009,11(4):53-54.

[2]林莉,黃秀深,羅明鳳，等. 中焦濕阻證Cajal細胞內乳酸脫氫酶和琥珀酸脫氫酶活力變化及平胃散的干預研究[J].時珍國醫國藥,2011,22(11):2575-2577.

[3]Sivakolundu SG，Mabrouk PA.Structure-function relationship of reduced cytochrome c probed by complete solution structure determination in 30% acetonitrile/water solution[J].J Biol Inorg Chem, 2003，8(5):527-539.

[4]翁一潔,鄭學寶.大鼠內因濕熱造模方法研究[J].時珍國醫國藥,2010,21(2):479-480.

[5]王利芳,喬樵,朱曙東.云香復合胃痛膠囊對慢性淺表性胃炎大鼠胃分泌功能的影響[J].中國中西醫結合消化雜志,2008,16(6):372-374.

[6]宋雅芳,王汝俊,劉友章,等.健脾益氣中藥對脾虛大鼠肝組織線粒體功能的影響[J].中藥新藥與臨床藥理,2009,20(5):423-426.

[7]爾森.生物化學精華[M].張增明,譯.上海:上海科學普及出版社,1989:88-242.

[8]陳群,劉亞梅,徐志偉,等.實熱證、虛熱證模型大鼠肝細胞琥珀酸脫氫酶活性研究[J].北京中醫藥大學學報,2000, 23(5):48-49.

[9]劉旺根,王紅霞,王雪萍.黃芪建中湯對大鼠脾虛證胃粘膜酶組織化學的影響[J].浙江中醫雜志,2004,39(8):355-356.

[10]王叨，劉玉峰.細胞色素C與細胞凋亡的研究進展[J].中國小兒血液，2004，9(4)：181-183.

[11]劉友章，王昌俊，周俊亮，等.四君子湯修復脾虛大鼠線粒體細胞色素氧化酶的作用及機制[J]．中國臨床康復，2006，10(35):118-121.

(本文編輯：蒲曉田)

·論著·

作者單位：210002 南京軍區南京總醫院中西醫結合科

Contrast of succinate dehydrogenase vitality and cytochrome C content in rats of different syndromes of chronic superficial gastritisWANGLi,LIYi-meng.NursingCollegeofLiaoningUniversityofTraditionalChineseMedicine,Shenyang110847,China

【Abstract】ObjectiveTo explore the mechanisms of different syndromes in terms of the energy metabolism by observing the activity changes of succinate dehydrogenase (SDH)and the content changes of cytochrome C (Cyt-C) in rats with chronic superficial gastritis (CSG) of spleen-deficiency syndrome and damp-heat syndrome. MethodsCSG rat model was established by the intragastric administration of sodium salicylate solution. CSG rat model with spleen-deficiency syndrome was established by Xiaochengqi Decoction-induced purgation and eating disorders. CSG rat model with damp-heat syndrome was established by feeding fat, sweet and spicy diet. Five weeks later, SDH activity and Cyt-C content of gastric tissue were determined. ResultsThe activity of SDH in damp-heat CSG group was the highest of all, but which in spleen-deficiency CSG group was the lowest . The activity of SDH was obviously changed in damp-heat CSG group also in spleen-deficiency CSG group in comparison with the other three groups, respectively.(P<0.05 or P<0.01). The content of Cyt-C in the three model groups was higher than which in normal group(P<0.05 or P<0.01). The content of Cyt-C in spleen-deficiency CSG group was the highest of all, with the damp-heat CSG group secondarily. There was a significantly content difference between the two groups (P<0.01) . ConclusionThe difference in the SDH activity and Cyt-C content of CSG rat with different syndromes , revealed the different energy metabolism of different syndromes for the same disease, the energy metabolism of damp-heat symdrome was higher than which of spleen-deficiency syndrome.

【Key words】Damp-heat syndrome;Spleen-deficiency syndrome;Succinate dehydrogenase;Chronic superficial gastritis

作者簡介：趙凌杰(1966- )，女，博士，副主任醫師，研究生導師。研究方向：中西醫結合治療風濕免疫。E-mail：zhaolingjie68@163.com

基金項目：南京軍區南京總醫院科研基金(2013056)

(收稿日期：2014-03-08)

Corresponding author:WANG Li,E-mail: wltcm@126.com

【中圖分類號】R573.3+1

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.012