基于藥物體系質(zhì)量評價模式的石菖蒲質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析研究

張璐 李煥娟 朱乃亮 彭平 孫道涵 孫雅姝 遲蕾 姜艷艷 石任兵

石菖蒲為天南星科多年生草本植物石菖蒲Acorus tatarinowii Schott 的干燥根莖，具芳香化濕，開竅寧神等功效，用于治療癲癇、驚厥、健忘、老年癡呆等證。其中，2010 版《中華人民共和國藥典》(一部)收錄的石菖蒲含量測定方法為測定石菖蒲中總揮發(fā)油的量［1］，以揮發(fā)油含量表征石菖蒲的質(zhì)量。在研究石菖蒲藥物中，本課題組發(fā)現(xiàn)石菖蒲藥物成分苯丙素類與酚類相互作用與其鎮(zhèn)靜、抗抑郁藥效的關(guān)聯(lián)性［2-6］，并建立了有效物質(zhì)分離富集方法［7-8］。

在運用本課題組建立的藥代動力學(xué)—藥效動力學(xué)—藥物成分相互作用關(guān)聯(lián)分析方法(pharmacokinetics-pharmacodynamics-drug interactions，PK-PDDI)研究經(jīng)方遠(yuǎn)志湯、開心散(遠(yuǎn)志、石菖蒲、茯苓、人參)以及組成單味藥，抗癡呆、抗抑郁藥物體系時，筆者發(fā)現(xiàn)石菖蒲芳香酸類與苯丙素類同為藥物體系組成成分。中藥化學(xué)成分的有效性與其質(zhì)量性有關(guān)，即與中藥化學(xué)成分的類型以及存在的量、組成比例等有關(guān)［9-11］。

本文報道運用課題組所建立的基于藥物體系的中藥質(zhì)量評價模式［12］，對石菖蒲進(jìn)行質(zhì)量評價與控制。即基于藥物體系的石菖蒲芳香酸類(原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸之和)與苯丙素類(β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚之和)有效指標(biāo)性成分的含量測定，關(guān)注有效指標(biāo)性成分的含量及組成比例，并與有效性確切的基準(zhǔn)飲片進(jìn)行關(guān)聯(lián)度分析比較與質(zhì)量綜合考量，以確定其飲片質(zhì)量優(yōu)良度，為石菖蒲的有效應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)，亦為有關(guān)藥物的質(zhì)量保障提供支撐。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Waters e2695 高效液相色譜儀，Empower Pro 軟件系統(tǒng)，2998 二極管陣列檢測器;METTLER-AE240型電子分析天平(北京賽多利斯儀器有限公司);KQ-500DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司)。

1.2 試藥

原兒茶酸(批號121009，純度≥98%)、香草酸(批號120915，純度≥98%)、α-細(xì)辛醚(批號100298-201203，純度100%)均購自北京方程生物科技有限公司，2，4，5-三甲氧基苯甲酸(批號20130816，純度97%)購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，β-細(xì)辛醚(批號00011017-T9K，純度95%)購自天津一方科技有限公司，乙腈(色譜級，F(xiàn)isher Scientific 公司)，甲醇(分析純，北京化工廠)，乙酸(分析純，北京化學(xué)試劑公司);娃哈哈純凈水(杭州娃哈哈集團(tuán)有限公司)，其余試劑均為分析純。

15 批石菖蒲飲片購自于北京同仁堂藥材有限責(zé)任公司及北京金象大藥房，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)生藥系劉春生教授鑒定為石菖蒲Acorus tatarinowii Schott 的干燥根莖，有關(guān)樣品進(jìn)行編號后存放在北京中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院中藥化學(xué)系。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

Thermo Hypersil GOLD (C18)液相色譜柱(250 mm×4.6 mm × 5 μm)，流動相乙腈(A)-0.2%乙酸水(B)，洗脫梯度(0 ～5 分鐘，0% ～2%A;5 ～10 分鐘，2% ～5% A;10 ～11 分鐘，5% ～6%A;11 ～14 分鐘，6% ～8%A;14 ～17 分鐘，8%A;17 ～27 分鐘，8% ～10% A;27 ～40 分鐘，10% ～13%A;40 ～50 分鐘，13% ～15%A;50 ～52 分鐘，15% ～30%A;52 ～55 分鐘，30% ～45%A;55 ～60分鐘，45% ～47%A;60 ～67 分鐘，47%A;67 ～70 分鐘，47% ～100%A)，流速1.0 mL/min，柱溫25℃，檢測波長256 nm，進(jìn)樣量10 μL。

上述色譜條件下，石菖蒲對照品及飲片的HPLC 譜圖見圖1。采用二極管陣列檢測器在190 ～400 nm 全波長掃描，結(jié)果顯示5 種有效指標(biāo)性成分在256 nm 波長下有最大吸收且與其他色譜峰分離度良好，故選用256 nm 為檢測波長，確保待測成分均有最高的檢測靈敏度。

圖1 石菖蒲供試品(A)及對照品(B)的HPLC 色譜圖

2.2 對照品溶液的制備

分別取上述5 種對照品適量，精密稱定，加入甲醇制成每1 mL 含有原兒茶酸19.9 μg、香草酸19.1 μg、2，4，5-三甲氧基苯甲酸31.2 μg、β-細(xì)辛醚652.8 μg、α-細(xì)辛醚104.6 μg 的對照品混合溶液。

2.3 供試品溶液的制備

取石菖蒲飲片粉碎，過四號篩，稱取約2 g，精密稱定，置于100 mL 圓底燒瓶中，精密加入50%甲醇50 mL，加熱回流提取60 分鐘，趁熱過濾，提取3 次，合并濾液，回收溶劑至干，殘渣加70%甲醇使溶解，定容至10 mL，即得。

2.4 線性關(guān)系考察

將“2.2”項下對照品混合溶液進(jìn)樣1 μL，4 μL，8 μL，16 μL，32 μL，48 μL，以進(jìn)樣量(μg)為橫坐標(biāo)，峰面積為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算回歸方程及相關(guān)系數(shù)，結(jié)果見表1。

對小區(qū)邊界及住宅周邊進(jìn)行智能監(jiān)控，檢測入侵、盜搶、翻墻等異常行為并自動報警，第一時間發(fā)現(xiàn)危險情況，保障小區(qū)/校園安全。

表1 5 種成分的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和線性范圍(n=6)

2.5 精密度試驗

取“2.3”項下同一石菖蒲樣品溶液，連續(xù)進(jìn)樣6次，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的峰面積的RSD 分別為2.97%，2.47%，1.40%，0.68%，0.67%，精密度良好。

2.6 重復(fù)性試驗

取同一石菖蒲飲片樣品，按“2.3”項下方法平行制備供試品溶液6 份，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的平均含量分別為0.0026%、0.0015%、0.0016%、0.6897%、0.0901%，RSD 分別為2.83%，0.62%，1.53%，0.85%，0.55%，重復(fù)性良好。

2.7 穩(wěn)定性試驗

取“2.3”項下同一供試品溶液，于室溫下放置，分別于0 小時，2 小時，4 小時，8 小時，12 小時，24小時進(jìn)樣，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的峰面積的RSD 分別為2.83%，2.04%，2.17%，0.38%，0.61%，供試品溶液在24 小時內(nèi)穩(wěn)定。

2.8 加樣回收率試驗

稱取同一石菖蒲樣品粉末(過四號篩)約1 g 共6 份，精密稱定，加入對照品適量，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，進(jìn)樣，測得原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的加樣回收率分別為99.59%、99.14%、100.15%、100.33%、100.14%，RSD 分別為2.97%、2.93%、1.72%、0.51%、1.44%，加樣回收率合格，說明本方法準(zhǔn)確、可靠，結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗結(jié)果

2.9 石菖蒲質(zhì)量表征

2.9.1 基于有效指標(biāo)性成分含量的質(zhì)量表征 取15 個石菖蒲飲片樣品，按“2.3”項下方法制備供試品溶液，每個平行制備3 份，照“2.1”項色譜條件進(jìn)樣，測定原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚的含量，對石菖蒲飲片中有效指標(biāo)性成分含量進(jìn)行全面表征，結(jié)果見表3。

2.9.2 基于有效指標(biāo)性成分含量相對比值的質(zhì)量表征 以藥物體系中關(guān)鍵有效指標(biāo)性成分香草酸的含量為基準(zhǔn)，將15 個石菖蒲飲片樣品中各有效指標(biāo)性成分含量與香草酸含量的相對比值予以表征，結(jié)果見表4。

2.10 石菖蒲質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析

2.10.1 基于與基準(zhǔn)飲片有效指標(biāo)性成分含量相對比值的質(zhì)量表征的關(guān)聯(lián)分析 基于“2.9.1”項下表3進(jìn)行15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)分析，如表3所示，15 個石菖蒲飲片中各有效指標(biāo)性成分含量相差較大，并計算最高比值與最低比值的比，以反映各飲片中有效指標(biāo)性成分含量的差異。原兒茶酸含量最大相差約1.84 倍，含量從高到低排序為:樣品9＞3＞7＞14＞2＞6＞15＞11＞12＞1＞10＞8＞4＞5＞13;香草酸含量最大相差約2.0 倍，含量從高到低排序為:樣品11＞12＞1＞15＞13＞10＞7＞9＞3＞14＞2＞6＞8＞5＞4;2，4，5-三甲氧基苯甲酸含量最大相差約5.2 倍，含量從高到低排序為:樣品1＞3＞9＞14＞15＞6＞7＞5＞12＞2＞10＞4＞13＞11＞8;芳香酸類含量和最大相差約1.81倍，含量從高到底排序為:樣品9＞1＞3＞14＞15＞7＞6＞12＞11＞2＞10＞5＞13＞4＞8;β-細(xì)辛醚含量最大相差約3.5 倍，含量從高到低排序為:樣品12＞1＞4＞11＞9＞6＞7＞15＞14＞10＞5＞13＞3＞2＞8;α-細(xì)辛醚含量最大相差約10.8 倍，含量從高到低排序為:樣品12＞9＞14＞6＞1＞15＞5＞7＞8＞10＞3＞13＞2＞4＞11;苯丙素類含量和最大相差約3.8 倍，含量從高到底排序為:樣品12＞9＞6＞14＞1＞7＞4＞15＞11＞5＞10＞13＞3＞2＞8。

表3 基于有效指標(biāo)性成分含量的15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征(mg/g，n=3)

可見，在15 個石菖蒲飲片樣品中有效指標(biāo)性成分含量差異性:α-細(xì)辛醚(10.8 倍)＞2，4，5-三甲氧基苯甲酸(5.2 倍)＞苯丙素類含量和(3.8 倍)＞β-細(xì)辛醚(3.5 倍)＞香草酸(2 倍)＞原兒茶酸(1.84倍)＞芳香酸類含量和(1.81 倍);而基于原兒茶酸、香草酸、2，4，5-三甲氧基苯甲酸、芳香酸類含量和、β-細(xì)辛醚、α-細(xì)辛醚、苯丙素類含量和進(jìn)行綜合考量，樣品1、6、9、12、14 中有效指標(biāo)性成分含量總體高于有效性確切的基準(zhǔn)飲片樣品15［13］，樣品7 中有效指標(biāo)性成分含量與樣品15 接近。

2.10.2 基于與基準(zhǔn)飲片有效指標(biāo)性成分含量相對比值的比值質(zhì)量表征的關(guān)聯(lián)分析 將“2.9.2”項下表4以樣品15 為基準(zhǔn)，將15 個石菖蒲飲片中有效指標(biāo)性成分含量相對比值與基準(zhǔn)飲片樣品15 的相對比值的比值進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析得表5、圖2。

表4 基于有效指標(biāo)性成分含量相對比值的15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量表征

圖2中不同顏色的矩形條代表各飲片中有效指標(biāo)性成分含量相對比值與樣品15 對應(yīng)成分含量相對比值的比值，矩形條大小與樣品15 中相同顏色的矩形條大小越相近，代表該飲片有效指標(biāo)性成分含量比值與樣品15 越接近，即質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)密切。可以看出，樣品1、5、7 與15 質(zhì)量表征關(guān)聯(lián)密切。以樣品15 為基準(zhǔn)，其他樣品與其相對比值的比值差值的絕對值之和，即非關(guān)聯(lián)系數(shù)δ;非關(guān)聯(lián)系數(shù)與有效指標(biāo)性成分的數(shù)目的比值，即非關(guān)聯(lián)度，進(jìn)而得到關(guān)聯(lián)度，以反映飲片質(zhì)量之間的關(guān)聯(lián)性，得表5。

由表5可知，關(guān)聯(lián)度由高到低排序為樣品15(0/100%)＞7 (0.8573/87.75%)＞1 (1.1368/83.76%)＞10 (1.1428/83.67%)＞2 (1.4900/78.71%)＞13 (1.8837/73.09%)＞5 (2.0236/71.09%)＞3 (2.0273/71.04%)＞8 (2.1988/68.59%)＞11 (2.1990/68.59%)＞12 (2.5758/63.20%)＞4 (2.9056/58.49%)＞14 (3.3258/52.49%)＞9 (3.8515/44.98%)＞6 (4.1389/40.87%)，即樣品7、1、10 與基準(zhǔn)樣品15 質(zhì)量關(guān)聯(lián)性最高，而樣品6、9 與基準(zhǔn)樣品15 質(zhì)量關(guān)聯(lián)性相差較大。

表5 15 個石菖蒲飲片樣品關(guān)聯(lián)度表征

圖2 15 個石菖蒲飲片中各有效指標(biāo)性成分含量相對比值與基準(zhǔn)飲片樣品15 對應(yīng)成分含量相對比值的比值

3 結(jié)論

本文基于藥物體系質(zhì)量評價模式，對石菖蒲進(jìn)行質(zhì)量表征及關(guān)聯(lián)分析研究，確定出樣品1、6、9、12、14 有效指標(biāo)性成分含量總體高于基準(zhǔn)樣品15，樣品7 有效指標(biāo)性成分含量與基準(zhǔn)樣品15 接近。其中樣品7、1、10 與基準(zhǔn)樣品15 關(guān)聯(lián)性最高，綜合評價得出樣品1 及樣品7 質(zhì)量優(yōu)良度居前，其次為樣品6、9、12、14、10。

中藥飲片質(zhì)量與其所含有效化學(xué)成分類型及存在的量、組成比例等有關(guān)。本文在自然藥學(xué)觀相關(guān)理論的指導(dǎo)下，基于藥物體系組成成分的發(fā)現(xiàn)，運用有關(guān)中藥質(zhì)量評價模式，對15 個石菖蒲飲片樣品質(zhì)量進(jìn)行表征，并以具有確切藥效的樣品15 為基準(zhǔn)，進(jìn)行質(zhì)量關(guān)聯(lián)度分析比較，綜合精準(zhǔn)評價出石菖蒲飲片質(zhì)量的優(yōu)良度。即綜合考量了石菖蒲應(yīng)用有效性及質(zhì)量關(guān)聯(lián)性，從而為石菖蒲資源篩選及其藥物的原料質(zhì)量控制及應(yīng)用提供了依據(jù)，亦為中藥藥材及其飲片的質(zhì)量評價提供了研究借鑒。

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