扶正散結湯拆方配伍中藥抑制Lewis肺癌生長和對腫瘤細胞周期的影響

竇永起 陳慧彬 陳超

細胞周期調控異常與腫瘤的發生和發展的關系密切，中醫藥在治療肺癌的過程中顯著提高了治療的有效率和患者的臨床獲益率、疾病穩定率，顯著延長腫瘤進展時間［1］。自擬扶正散結湯是臨床經驗方，經多年臨床實踐證明，在穩定肺癌病灶、延緩腫瘤復發轉移及延長患者生存期等方面均有一定療效。為探討其作用機制，本研究采用小鼠lewis肺癌移植瘤模型，觀察其拆方配伍中藥對腫瘤生長、組織病理、細胞周期和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 實驗動物

SPF級C57BL/6小鼠90只，雄性6～8周齡，體質重18～22 g，初進動物時間:2013年7月26日，由中國人民解放軍軍事醫學科學院實驗動物中心提供，動物合格證號:SCXK(軍)2012-0004。其中10只用于移植瘤細胞傳代，70只建立小鼠皮下移植瘤動物模型，另外10只小鼠作為空白組，用于一般情況觀察、對比及排除小鼠非正常死亡情況。

1.2 瘤株

Lewis Lung Cancer瘤株由軍事醫學科學院六所饋贈。

1.3 試劑及儀器

順氯氨鉑，齊魯制藥公司生產(批號:2030111DB)，核糖核酸酶(RNase A)(批號:SLBD3952V)由Sigma公司生產;流式細胞儀(Cytomics FC 500，Beckman Coulter)。

1.4 分組及小鼠Lewis肺癌移植瘤模型制備

SPF級C57BL/6小鼠90只，其中10只用于移植瘤細胞傳代，其余80只隨機分為:空白組、模型組、順氯氨鉑組、益氣扶正組(簡稱扶正組)、化痰散結組(簡稱化痰組)、活血化瘀組(簡稱活血組)、清熱解毒組(簡稱解毒組)、中藥聯合組(簡稱聯用組)，每組10只。按照文獻方法制備小鼠Lewis移植瘤模型［2］。復蘇Lewis肺癌瘤株，在無菌條件下接種于2只C57BL/6小鼠右腋窩皮下，10天后按無菌操作程序，脫頸處死小鼠，取生長良好腫瘤組織，用生理鹽水洗凈剪碎后加生理鹽水用勻漿器研磨，臺盼藍染色計算活細胞數＞95%，調整腫瘤細胞懸液濃度為1×107/mL瘤細胞繼續皮下接種4只小鼠，每只接種0.l mL，如此傳代3次。除空白組外，其余組小鼠按同樣方法接種傳代完成后的肺癌移植瘤細胞。

1.5 藥品及制備

將扶正散結湯按配伍拆分為益氣扶正(簡稱扶正，由生黃芪25 g、女貞子15 g組成)，化痰散結(簡稱化痰，由半夏15 g、天南星10 g組成)，活血化瘀(簡稱活血，由莪術15 g、郁金15 g組成)，清熱解毒(簡稱解毒，由白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)，四法聯用(簡稱聯用，由生黃芪25 g、女貞子15 g、半夏 15 g、天南星 10 g、莪術 15 g、郁金15 g、白花蛇舌草15 g、半枝蓮15 g組成)5個組分，以上藥物均由解放軍總醫院中藥房提供，經鑒定后，傳統方法水煎、過濾、60℃濃縮，參照文獻［3］計算各中藥組給藥量，分別配制成含生藥濃度為0.8 g/mL、0.4 g/mL、0.6 g/mL、0.6 g/mL、2.45 g/mL 的藥液，置4℃保存備用。

1.6 給藥

于接種后的第2天開始，各中藥組分別給予相應中藥煎劑0.2 mL/d，空白組、模型組、順氯氨鉑組給予等體積的蒸餾水，連續灌胃14天;順氯氨鉑組在接種的第2天開始予以腹腔注射順氯氨鉑2 mg/(kg·d)，1次/2天，共7次，其余各組同時腹腔注射生理鹽水10 mL/kg。

1.7 觀察項目

一般情況觀察:每日觀察各組小鼠體態、毛色、進食、活動等情況。

抑瘤率:于給藥后第14天脫頸處死小鼠，剝取瘤塊，天平稱重，計算抑瘤率:抑瘤率=(1－實驗組平均瘤重/模型組平均瘤重)×100%

病理HE染色:取各組移植瘤用10%甲醛固定，常規石蠟包埋，應用組織切片蘇木素—伊紅染色法，光鏡下觀察。觀察腫瘤細胞的分布、生長狀態、核固縮、核碎裂和壞死，以及瘤組織內微血管分布情況。

流式細胞術檢測瘤組織細胞周期:將小鼠瘤體剝離稱重后，每組取小塊瘤組織，并分別浸泡在含有PBS的平皿中，用眼科剪將瘤組織剪碎、勻漿，制成瘤細胞懸液，100目不銹鋼網過濾，PBS洗2次，每次1000 r/min離心5分鐘，75%乙醇固定，置于4℃冰箱內過夜。次日離心，PBS洗1次調整細胞濃度為1×107/mL后離心，小心棄上清液，用含有終濃度為1 mg/mL RNaseA酶加100μL后混勻，之后加PI染液0.4 mL避光染色30分鐘，上流式細胞儀檢測細胞周期及凋亡率的變化［4］，結果以細胞周期各時相細胞百分比表示。

1.8 統計學方法

采用SPSS 13.0統計軟件進行統計學處理。瘤重數據符合正態性檢驗及方差齊情況，以均數±標準差±s)表示，采用單因素方差分析;抑瘤率數據符合正態性檢驗但方差不齊，采用Kruskal-Wallis法秩和檢驗，平均等級間的兩兩比較;細胞周期及凋亡率數據均采用單因素方差分析，以均數±標準差±s)表示，兩組之間采用均數兩兩比較(Dunnett法)。以P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組Lewis肺癌小鼠一般情況觀察

接種后第六天，小鼠右前肢腋下可觸及黃豆大小瘤塊，造模后第7天，小鼠瘤體生長明顯加快。與空白組相比，造模后小鼠逐漸出現反應遲鈍、動作遲緩、毛發無光澤，模型組小鼠出現拱背、喜靜、蜷縮抱團的現象，順氯氨鉑組小鼠出現體溫降低、體重增長緩慢，各中藥組大部分小鼠行動較靈活，精神狀態一般，飲食尚可，體重增長較模型組及順氯氨鉑組快。除空白組和順氯氨鉑組外，其余組小鼠出現少量死亡，多由于腫瘤增長較快壓迫肺組織導致呼吸困難，以及后期出現消瘦、不進食飲水等腫瘤惡病質現象，個別小鼠因皮下腫瘤潰爛出血后，被同籠小鼠撕咬所致。

2.2 扶正散結拆方對Lewis肺癌移植瘤的瘤重及抑瘤率的影響

盡管各組有死亡，但其生存率各組無統計學差異。各組瘤重經單因素方差分析比較，差異有統計學意義(F=10.98，P＜0.05)。兩兩比較經Dunnett法，與模型相比，其余各組瘤重均顯著降低，各中藥組以聯用組抑瘤作用最為明顯，其次為扶正組和解毒組;各中藥組瘤重及抑瘤率獨立比較差異也具有統計學意義(P＜0.05)，其中聯用組抑瘤率最高，為63.63%，化痰組和活血組與聯用組相比，差異具有統計學意義(P＜0.05)。見表1。

表1 扶正散結湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌的抑制作用±s)

表1 扶正散結湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌的抑制作用±s)

注:與模型組比較，a P＜0.05，b P＜0.01;與順氯氨鉑組比較c P＜0.05，d P ＜0.01;與聯合組比較，e P ＜0.05，f P ＜0.01。

組別 瘤重(g) 抑瘤率(%)空白組(n=10) — —63.63模型組(n=9) 3.10±0.76 —順氯氨鉑組(n=10) 0.92±0.34b 70.39扶正組(n=8) 1.16±0.48b 62.45化痰組(n=9) 2.06±0.51adf 33.43df活血組(n=9) 1.99±1.07adf 35.88de解毒組(n=8) 1.67±0.77bd 46.15c聯用組(n=9) 1.13±0.62b

2.3 扶正散結拆方對腫瘤組織病理學變化的影響

光鏡下觀察，腫瘤細胞形態多樣，核不對稱分裂明顯。模型組腫瘤組織中細胞生長旺盛，數量豐富排列緊密，形狀不規則，呈片狀分布，腫瘤實質和間質分界不清，病理性核分裂相多見，細胞壞死較少;順氯氨鉑組及各中藥組細胞數目較模型組稀疏，呈散在、條索狀分布，均可見不同程度的片狀壞死區及核固縮、核破碎溶解的現象。見圖1。

2.4 扶正散結拆方對Lewis肺癌移植瘤細胞周期及凋亡率的影響

細胞周期及凋亡率的比較采用單因素方差分析。G0/G1期比例各組間差異有統計學意義(F=14.13，P ＜0.05)，兩兩比較經 Dunnett法，各治療組均較模型組增高;凋亡率各組間差異有統計學意義(F=19.41，P ＜0.01)，兩兩比較經 Dunnett法，各治療組均較模型組顯著增加。除扶正組及活血組外，其余各組腫瘤細胞在G2/M期的比例明顯減少(P＜0.05);化痰組及解毒組在G0/G1期比例高于順氯氨鉑組及聯用組，其余拆方組盡管未顯示顯著性差異，但趨勢清晰;扶正散結各拆方組凋亡率獨立比較具有統計學差異(P＜0.01)，以聯用組凋亡率最高，其次為解毒組、化痰組、活血組、扶正組。見表2。

3 討論

圖1 扶正散結拆方各組對腫瘤組織學的影響(HE，×400)

表2 扶正散結湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌細胞周期的影響 ± s，%)

表2 扶正散結湯拆方各組對小鼠Lewis肺癌細胞周期的影響 ± s，%)

注:與模型組比較，a P ＜0.05，b P ＜0.01;與順氯氨鉑組比較c P ＜0.05，d P＜0.01;與聯合組比較，e P ＜0.05，f P ＜0.01。

凋亡率模型組(n=9) 22.05±6.19 11.86±4.92 66.08±10.44 9.40±1.87組別 G0/G1 S G2/M順氯氨鉑組(n=10) 39.37±2.97b 26.71±4.96a 33.92±7.21b 20.03±1.72b扶正組(n=8) 32.47±4.26a 13.49±2.85c 54.04±5.61d 13.63±0.89bdf化痰組(n=9) 50.44±2.07bce 5.45±3.28de 44.11±3.68b 17.89±0.39b活血組(n=9) 31.82±7.19a 8.95±8.54d 59.23±4.84de 14.10±2.86bdf解毒組(n=8) 51.48±6.06bce 7.86±4.79d 40.66±2.38b 19.06±0.92b聯用組(n=9) 37.32±2.45b 19.22±2.14 43.46±3.18b 19.57±0.76bd

研究表明，細胞周期調控紊亂是細胞增殖失控從而導致癌變的重要原因［5］。細胞周期不同時相(G1、S、G2、M)與細胞周期的關鍵調控點密切相關，由于細胞的周期長短主要決定于G1期時間長短，所以最重要的調控點是G1/S調控點，細胞在該點分析細胞內、外的各種復雜信號以及DNA損傷情況，將信號傳遞、整合、匯集到細胞核，以決定細胞周期的長短、細胞處于靜止的G0期或誘發其凋亡。因此，影響和調控腫瘤的細胞周期在腫瘤的治療中具有重要意義。

對腫瘤細胞周期影響的觀察結果表明，拆方各組均可作用于細胞周期中的G1/S調控點，使腫瘤細胞停滯于G0～G1期，而不進入S期進行DNA復制，以化痰組及解毒組作用最優;但在抑制荷瘤小鼠的腫瘤細胞生長及促進凋亡方面，聯合組效果最佳，說明聯合應用可以發揮其它組分，如扶正及活血組分，促進腫瘤細胞壞死、誘導腫瘤細胞凋亡及其它機制如增強機體免疫力、抑制腫瘤血管生成等方面的作用，這體現了中藥復方配伍的重要價值，也提示運用現代分子生物學等新技術，對中藥復方配伍的作用靶點及途徑進行深入研究，對于提高中醫藥抗腫瘤的理論認識，及提高臨床配伍運用的合理性和有效性，具有非常重要的價值。

［1］ 劉碩．中醫藥參與治療晚期(ⅢB、Ⅳ期)NSCLC回顧性臨床研究［D］．北京:中國中醫科學院，2009．

［2］ 鐘婷．黃茂扶正湯抗腫瘤與免疫調節作用的初步研究［D］．長沙:中南大學湘雅醫院，2010．

［3］ 陳奇．中藥藥理研究方法學［M］．北京:人民衛生出版社，2011:1262．

［4］ 婁金麗，邱全瑛，何秀娟，等．威麥寧對小鼠Lewis肺癌細胞周期的影響［J］．北京中醫藥大學學報，2004，(2):41-44．

［5］ Marx J．How cells Cycle Toward Cancer［J］．Science，1994，(263):319-321．