葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的量—時—效影響

劉明 陳紹紅 鐘贛生 柳海艷 趙桐

酒精性肝病(alcoholic liver disease，ALD)是因長期大量攝入酒精而造成的肝臟損傷疾病。隨著酒精攝入量的增加，該疾病呈漸進(jìn)性發(fā)展，可從最初的酒精性脂肪肝發(fā)展為酒精性肝炎、酒精性肝纖維化及酒精性肝硬化［1］。隨著生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的變化，人們社交應(yīng)酬增多以及生存競爭壓力增大，酗酒和酒精中毒呈日益增多趨勢。在歐美發(fā)達(dá)國家，酒精性肝病的發(fā)病形式主要以酒精性脂肪肝為主;在中國，酒精性疾病的發(fā)生率也與日俱增，主要以酒精性肝炎為主［2］。乙醇及其代謝產(chǎn)物和代謝過程中產(chǎn)生的代謝混亂是導(dǎo)致酒精性肝病的重要原因［3］。在古代文獻(xiàn)記載中，葛花枳椇子是最具有代表性的解酒藥對，葛花功用為解酒醒脾，枳椇子具有清熱利尿，解酒毒的功效，二者也較少用于其他疾病的治療。實(shí)驗(yàn)組前期通過借助現(xiàn)代科學(xué)技術(shù)方法與手段，進(jìn)行了葛花和枳椇子不同比例配伍(1∶1、1∶2、和2∶1)，不同的提取方法(水提和醇提)對大鼠慢性酒精性肝損傷的防治研究，結(jié)果表明葛花枳椇子2∶1比例配伍采用傳統(tǒng)水提解酒保肝效果最佳［4］。本實(shí)驗(yàn)在此基礎(chǔ)上，通過研究酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性，探討不同劑量的葛花枳椇子2∶1比例配伍后解酒保肝是否存在量-時-效關(guān)系。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動物與分組

選取健康雄性Wistar 大鼠，體質(zhì)量180 ～200 g，由北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司提供。許可證編號為SCXK(京)2012-0001。適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后，按體重隨機(jī)分為6 組:空白組、模型組、東寶甘泰組、配伍低劑量組、配伍中劑量組、配伍高劑量組，其中空白組30 只，模型組、東寶甘泰組、配伍各劑量組每組各50 只。

1.2 實(shí)驗(yàn)藥物與試劑

1.2.1 實(shí)驗(yàn)藥物 葛花為豆科植物野葛Pueraria lobata (Willd.)Ohwi 的花。枳椇子為鼠李科植物枳椇Hovenia dulcis Thunb 的干燥成熟種子。兩種藥材均購自北京本草方源藥業(yè)有限公司，經(jīng)北京中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院中醫(yī)方藥系李偉老師鑒定均為優(yōu)質(zhì)藥材。

葛花枳椇子混合煎液的制備:將葛花、枳椇子按2∶1的比例混合浸泡0.5 小時，第一次加10 倍量水煎煮提取1.5 小時，第二次加8 倍量水煎煮1 小時。濾過，合并濾液，濃縮至一定濃度。使用時，加去離子水配制成含生藥12 g/mL、6 g/mL、3 g/mL 濃度的藥液。

東寶肝泰藥液的制備:使用時用去離子水配成0.036 g/mL 濃度的藥液。

1.2.2 主要實(shí)驗(yàn)試劑 56°紅星二鍋頭酒:購自北京紅星股份有限公司;東寶甘泰片:吉林通化東寶藥業(yè)股份有限公司生產(chǎn)，批號為:090503;生理鹽水:山東齊都藥業(yè)有限公司;組織乙醇脫氫酶(alcohol dehydrogenase，ADH)測定試劑盒:南京建成科技有限公司生產(chǎn)，批號為:20130412;無水乙醇:北京化工廠生產(chǎn)，批號為:20130320;肝素鈉:優(yōu)級純。中國醫(yī)藥公司北京公司;鹽酸氨基脲:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為:20111215;甘氨酸:北京東勝泰博科技有限公司;焦磷酸鈉:國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號為:F20110503;氫氧化鈉:北京化工廠生產(chǎn)，批號為:20121120;高氯酸:北京化工廠生產(chǎn);乙醇脫氫酶:SIGMA 公司進(jìn)口;氧化型輔酶Ⅰ:SIGMA公司進(jìn)口

1.3 主要實(shí)驗(yàn)儀器

臺式高速冷凍離心機(jī):型號為TGL-16A，長沙平凡儀器儀表有限公司;恒溫水浴鍋:北京光明醫(yī)療儀器廠;快速混勻器:型號為SK-1，江蘇國華儀器廠;微量移液器:北京青云航空儀表有限公司;752-C 紫外光柵分光光度計:上海第三分析儀器廠;電子分析天平:型號為AEL-160，日本產(chǎn)。

1.4 造模與給藥方法

大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)一周后開始造模，用56°紅星二鍋頭白酒灌胃，第1 周每天給酒8 mL/kg，1 次灌胃，連續(xù)2 周;第3 周每天給酒10 mL/kg，以后每周稱重，根據(jù)體重計算給酒量，連續(xù)12 周。除正常喂養(yǎng)外，空白組每天給予去離子水，灌胃體積為10 mL/kg，模型組給予56°紅星二鍋頭白酒灌胃，配伍各劑量組每日上午先給予相應(yīng)濃度的藥液，給藥體積為10 mL/kg，下午給予白酒灌胃。連續(xù)12 周，每周給大鼠稱重，自由進(jìn)食進(jìn)水。

1.5 對慢性酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

1.5.1 制作標(biāo)準(zhǔn)曲線 (1)用生理鹽水將新鮮正常大鼠全血(經(jīng)抗凝處理)稀釋，配成含乙醇量分別為25 mg/dL、50 mg/dL、100 mg/dL、200 mg/dL、400 mg/dL、800 mg/dL 的溶液。(2)上述各管加入3.4%高氯酸4 mL，混勻，于3000 r/min 離心5分鐘，取上清液作為標(biāo)準(zhǔn)液。(3)取6 只試管，分別加入乙醇脫氫酶(ADH)-氧化型煙酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD +)液4.9 mL;其中一支加蒸餾水0.1 mL，作為對照;其余五支各加0.1mL 標(biāo)準(zhǔn)液，室溫放置60 分鐘。用752-C 紫外可見分光光度計于340 nm 測各管吸收度，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線?；貧w方程為y =1806x +3.6398，R2=0.9976

1.5.2 樣品測試 大鼠280 只，按體重隨機(jī)分為6組:空白組、酒精組、東寶甘泰組、配伍低劑量(生藥3 g/kg)+酒精組、配伍中劑量(生藥6 g/kg)+酒精組、配伍高劑量(生藥12 g/kg)+酒精組?？瞻捉M30 只，其余各組各50 只。實(shí)驗(yàn)分別在4 周末、8 周末、12 周末取材，取材前所有大鼠均禁食不禁水12小時，用10%水合氯醛350 mg/kg 腹腔注射麻醉，腹主動脈取血，取少量新鮮血液，經(jīng)抗凝處理。在取血同時另取肝左葉約0.2 g，立即放入液氮中冷凍，之后置于-70℃冰箱中冷藏，備測乙醇脫氫酶活性(ADH)。

從每管抗凝血中取出0.25 mL，加生理鹽水0.75 mL，再經(jīng)去蛋白處理，余步驟與制作標(biāo)準(zhǔn)曲線相同。根據(jù)吸光度，用標(biāo)準(zhǔn)曲線求出乙醇質(zhì)量濃度。

1.6 乙醇脫氫酶檢測

測試時用手動勻漿器將肝組織在冰水中制成10%勻漿，4℃3000 轉(zhuǎn)/分鐘離心10 分鐘，提取上清液，備檢測。將測定ADH 試劑盒內(nèi)的試劑混勻，37℃預(yù)溫10 分鐘，加入待測液0.05 mL，加入樣本的同時開始計時，充分混勻，15 秒時340 nm 處，0.5 cm光徑，測定OD 值A(chǔ)1，迅速將反應(yīng)液置于37℃水浴鍋中，10分鐘15 秒時取出，測定OD 值A(chǔ)2。

計算公式為:肝組織勻漿中的ADH 活力(U/mgprot)=［測定(A2-A1)-空白(A2-A1)］÷ (6.22 ×0.5)×［反應(yīng)液總體積(mL)÷樣本量(mL)］÷反應(yīng)時間×1000÷10%組織勻漿蛋白含量(mgprot/mL)

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 11.5 統(tǒng)計軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理。各項(xiàng)檢測指標(biāo)的數(shù)據(jù)均采用均值±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)來表示，方差齊性檢驗(yàn)采用Levene 檢驗(yàn)，多組均數(shù)間的比較采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，兩兩均數(shù)間比較采用LSD 法，P ＜0.05 提示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。為保證檢測指標(biāo)的客觀真實(shí)性，統(tǒng)計數(shù)據(jù)時剔除不符合正態(tài)分布原則的界外值。

2 結(jié)果

2.1 葛花枳椇子2∶1配伍對酒精性肝損傷大鼠血中乙醇質(zhì)量濃度的影響

與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均有所降低，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)。給藥8 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度均明顯降低，有顯著性差異，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組相比(P ＜0.001)，有統(tǒng)計學(xué)差異，與高劑量組相比(P ＜0.01)，比較有統(tǒng)計學(xué)差異。給藥12 周后，各給藥組大鼠血中乙醇濃度亦均明顯降低，均有顯著性差異(P ＜0.001)，且配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，與中劑量組和高劑量組比較有統(tǒng)計學(xué)差異(P ＜0.01)，見表1。

表1 葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠血中乙醇濃度的影響

2.2 葛花枳椇子2∶1配伍對酒精性肝損傷大鼠肝中乙醇脫氫酶活性的影響

與空白組比較，模型組白酒灌胃4 周(P ＜0.05)、8 周(P ＜0.001)和12 周(P ＜0.001)后，肝中ADH 活性逐漸降低，均有統(tǒng)計學(xué)差異。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥肝中ADH 活性增強(qiáng)，但無統(tǒng)計學(xué)差異(P＞0.05)，其中低劑量組ADH 較高。給藥8 周后，東寶肝泰組(P ＜0.05)和配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異。給藥12 周后，配伍低劑量組(P ＜0.01)ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異，見表2。

表2 葛花枳椇子配伍對酒精性肝損傷大鼠肝中ADH 的影響

3 討論

肝臟是酒精代謝的重要場所，攝入體內(nèi)的乙醇98% ～90%在肝臟內(nèi)氧化，2% ～10%由呼吸道、尿液和汗腺以原形排出;肝臟代謝的乙醇80%通過乙醇脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙醛，約20%通過微粒體乙醇氧化酶轉(zhuǎn)化為乙醛，乙醛再經(jīng)乙醛脫氫酶轉(zhuǎn)化為乙酸，進(jìn)入三羧酸循環(huán)，氧化成二氧化碳和水(CH3CH2OH→CH3CHO →CH3COOH →CO2+ H2O)［5］。目 前ADL 的發(fā)病機(jī)制尚不明確，但認(rèn)為與多種因素有關(guān)［6］。

口服乙醇90% ～98%是通過以下3 個途徑代謝［7］:飲酒后，首先啟動0 級經(jīng)典途徑，即通過胞質(zhì)內(nèi)的乙醇脫氫酶和過氧化小體內(nèi)的過氧化氫酶進(jìn)行代謝;當(dāng)血液中乙醇濃度過高時，也啟動1 級代謝途徑，即通過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中的復(fù)合氧化酶系統(tǒng)進(jìn)行代謝，通過這3 種途徑將乙醇氧化分解為乙醛。乙醛對肝臟有直接毒性作用，可以造成肝細(xì)胞脂肪變性壞死等一系列變化。其中ADH 乙醇氧化體系在乙醇代謝中起重要作用。乙醇的肝毒性是由于乙醇脫氫酶介導(dǎo)過度產(chǎn)生還原型腺嘌呤二核苷酸及有高度毒性的乙醛的結(jié)果。肝細(xì)胞內(nèi)乙醇代謝有三個主要通路，其中之一是胞漿質(zhì)的ADH 通路。乙醇氧化過程中會同時伴隨2 分子的氧化性輔酶I(NAD+)轉(zhuǎn)化為還原型輔酶I(Nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)，這樣導(dǎo)致NADH/NAD 比值增高，進(jìn)而影響了NAD +依賴的過程，嚴(yán)重干擾了細(xì)胞新陳代謝，使三羧酸循環(huán)受到抑制［8］。此外，乙醇還會在代謝過程中促進(jìn)氧自由基(Reactive oxygen species，ROS)的產(chǎn)生，同時伴隨攝入不足等導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物減少，促發(fā)氧化應(yīng)激［9］。產(chǎn)生的自由基會抑制脂肪酸氧化，致使肝細(xì)胞脂肪蓄積。這是引起酒精性脂肪肝的主要原因。NADH 在340 nm 有吸收峰，故本實(shí)驗(yàn)采取測定單位時間內(nèi)生成的NADH 引起的吸收度變化率的方法，測定ADH 活性的變化。

正常情況下，ADH 在肝臟中含量最高，血清中的ADH 活性是恒定的，只有當(dāng)肝細(xì)胞受損時，ADH由肝細(xì)胞內(nèi)釋放入血，從而引起ADH 含量升高，所以檢測血清中的ADH 活性是診斷某些肝臟疾病的指標(biāo)之一。本研究觀察了葛花枳椇子配伍對酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的影響。從本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果可以看出，模型組大鼠肝組織中乙醇脫氫酶的活性較空白組明顯降低。與模型組比較，給藥4 周后，各給藥組肝中ADH 活性增強(qiáng)，但無統(tǒng)計學(xué)差異;給藥8 周和12 周后，配伍低劑量組ADH 活性增強(qiáng)，有顯著性差異。

有研究表明乙醇脫氫酶活性的變化可以影響到血中乙醇的濃度。當(dāng)乙醇脫氫酶活性受到抑制或下降時，導(dǎo)致機(jī)體對乙醇的吸收提高，從而加重乙醇對肝、腎、腦等臟器的損害。本實(shí)驗(yàn)另一研究結(jié)果表明隨著大鼠白酒灌胃時間的延長，血中乙醇濃度逐漸升高。給藥治療8 周和12 周后，葛花枳椇子各劑量配伍組均可明顯降低血中乙醇濃度，且至第12 周末，配伍低劑量組血中乙醇濃度最低，顯示一定的治療優(yōu)勢，提示隨著給藥時間的延長治療效果越好。

結(jié)合大鼠酒后血中乙醇質(zhì)量濃度和肝中乙醇脫氫酶活性的改變，可以看出給藥8 周和12 周后低劑量組大鼠肝中ADH 活性增強(qiáng)，血中乙醇濃度明顯降低。并且隨著給藥時間的延長，低劑量組可以通過增強(qiáng)乙醇脫氫酶活性加強(qiáng)肝臟對乙醇的代謝，降低對肝臟的損傷而起到一定的保肝效果。

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