姜黃素對佐劑性關節炎大鼠血清骨保護素和核因子κ B受體活化因子配體蛋白表達及骨密度的影響

趙凌杰　邱艷　商瑋　劉春麗　趙智明　郭郡浩　蔡輝

姜黃素對佐劑性關節炎大鼠血清骨保護素和核因子κ B受體活化因子配體蛋白表達及骨密度的影響

趙凌杰邱艷商瑋劉春麗趙智明郭郡浩蔡輝

【摘要】目的觀察姜黃素對佐劑性關節炎(adjuvant arthritis，AA)大鼠血清骨保護素(osteoprotegerin，OPG)、核因子κB受體活化因子配體(receptor activator for nuclear factor-κ B ligand，RANKL)表達以及骨密度的影響，探討姜黃素防止類風濕關節炎(rhuematoid arthritis，RA)骨破壞的作用機制。方法取SD大鼠30只，隨機分為模型組、姜黃素組及正常組，第28天腹主動脈取血，采用ELISA法來檢測血清中RANKL、OPG蛋白的表達，取血后處死大鼠，剝離大鼠右側脛骨，行骨密度檢查。結果(1)與正常組比較，造模組即模型組與姜黃素組大鼠血清RANKL均顯著升高(P<0.01)，血清OPG顯著降低(P<0.01)，RANKL/OPG比值顯著升高(P<0.01)；(2)與模型組比較，治療組即姜黃素組血清RANKL顯著降低(P<0.01)，血清OPG均顯著升高(P<0.01)，RANKL/OPG比值均顯著降低(P<0.01)；(3)3組大鼠脛骨整體骨密度無顯著性差異(P>0.05)，姜黃素組大鼠興趣區骨密度值顯著高于模型組(P<0.01)。結論姜黃素對AA大鼠具有良好的治療作用，能夠通過調節血清RANKL及OPG的表達，來調節OPG/RANKL通路，從而提高AA大鼠骨密度，抑制其骨丟失。

【關鍵詞】姜黃素；佐劑性關節炎；骨密度；骨保護素；核因子κB受體活化因子配體

姜黃素(curcumin)是從植物姜黃根莖中分離出來的天然多酚類產物。近年來在體外和體內對姜黃素進行了廣泛的研究[1-2]，發現姜黃素具有抗腫瘤、抗病毒、抗關節炎、抗氧化等作用，其作用機制涉及到多個靶點，包括轉錄因子如核因子κB(NF-κB)，生長因子如血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)，炎性細胞因子如腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)-α、白細胞介素1( interleukin 1，IL-1)、IL-6，蛋白激酶如絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase，MAPKs)和Akt，以及其他酶如環氧合酶2(cyclooxygenase-2，COX-2)。由于其有效性，安全性及多目標調控性，姜黃素成為一個潛在的治療及預防類風濕關節炎的藥物。

類風濕關節炎(rhuematoid arthritis，RA)是一種慢性炎癥性疾病，以多關節滑膜炎為特征伴隨軟骨及骨破壞，引起關節畸形，甚至導致患者殘疾。且RA的發病率隨著環境及空氣的污染呈逐年增高的趨勢[3]。RA骨破壞包括局灶性炎癥活動部位的骨侵蝕和關節周圍的骨量減少，其機制并未被完全闡明，諸多證據表明RANK/RANKL通路是RA的骨質流失的關鍵因素。RA動物模型支持RANK/RANKL系統在骨侵蝕中發揮作用，AA大鼠模型是最常見的RA動物模型，其造模方法簡單，成功率高[4]。本文通過觀察姜黃素對AA大鼠血清OPG、RANKL蛋白表達及骨密度的影響，進一步探討其對RA的作用機制，為姜黃素治療RA提供動物實驗參考。

1材料與試劑

1.1動物

雄性SD大鼠30只，清潔級，實驗起始體質量140～160 g，(南京軍區南京總醫院的實驗動物中心供應，使用許可證：SYXK20030032)。

1.2試劑

姜黃素溶液：濃度為5 mg/mL(將姜黃素500 mg溶解于無菌的二甲基亞砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)10 mL，加無菌生理鹽水直至100 mL，用5 mL注射器進行分裝，保存需要避光，冰箱溫度調節在-20 ℃，1周內使用完，禁止反復凍融。

2實驗方法

2.1分組及造模方法

將大鼠以隨機數字表法分為3組：正常組，模型組，姜黃素組，每組10只。用標準飼料飼養，飲水自由，將室溫控制在18～26℃之間，濕度調控在70%左右，適應性喂養1周。除了正常組不造模，將其余2組大鼠左后跖處進行常規消毒，皮內注射完全弗氏佐劑0.1 mL，制成AA模型，造模當天記做第0天。

2.2給藥方法

模型組、姜黃素組，于第7天開始腹腔注射給藥。姜黃素組給予姜黃素溶液50 mg/kg·d，連續21天；模型組給予10% DMSO，5 mg/kg·d，連續21天；正常組自由飲水。于最后一次姜黃素治療后24小時，即第28天將大鼠仰臥位固定頭部、四肢，行腹主動脈取血，離心，取血清，低溫冰箱保存備檢，ELISA法檢測血清RANKL、OPG蛋白的表達；取血后處死大鼠，剝離大鼠右側脛骨，雙能X線骨密度儀(dual energy x-ray absorptiometry，DXA)測量大鼠脛骨骨密度記做整體骨密度，及脛骨遠端1 cm處的興趣區域骨密度記為興趣區骨密度。

2.3檢測指標和方法

2.3.1整體及興趣區骨密度處死大鼠后，剝離大鼠右側脛骨，取其標本，用DXA進行檢測，記錄整個脛骨的整體骨密度及興趣區骨密度。

2.3.2血清RANKL、OPG蛋白表達參考文獻[5]及試劑盒說明，離心機離心→取血清保存備檢→激活標本→分別取OPG的ELISA試劑盒與RANKL的ELISA試劑盒→加入0.5 mL的蒸餾水混勻，配制成10 ng/mL溶液→標準管8管→第1管加入標本稀釋液900 μL→第2至8管加入標本稀釋液500 μL→在第1管中加入10 ng/mL的標準品溶液100 μL混勻后加樣器吸出500 μL移至第2管→如此反復稀釋，從第7管中吸出500 μL棄去，第8管為空白對照組→洗滌液：用重蒸水1:20稀釋→加樣：每孔各加入標準品或待測樣品100 μL，將反應板充分混勻后至37℃120分鐘→洗板：用洗滌液將反應板充分洗滌4～6次，向濾紙上印干→每孔加入第一抗體工作液100 μL，將反應板充分混勻后至37℃60分鐘→洗板：同前→每孔加入酶標抗體工作液100 μL，將反應板充分混勻后至37℃ 30分鐘→洗板：同前→每孔加入底物工作液100 μL，至37 ℃暗處15分鐘→每孔加入100 μL終止液混勻→30分鐘內用酶標儀在40 nm處測吸光值→結果計算：以標準品1000、500、250、125、62、31、15.6、0 pg/mL作為橫坐標，光密度(optical density，OD)值為縱坐標，建立標準曲線→經多元回歸計算結果。

2.4統計學處理

3結果

注射完全弗氏佐劑后3～4小時，造模組所有大鼠左后足即可出現紅、腫的炎癥表現；第3天左右達到高峰；第7天左右4只足爪均有不同程度的腫脹，表明造模成功。本實驗的造模成功率為100%。

3.13組大鼠骨密度的比較

3組大鼠右側脛骨整體骨密度之間比較均無顯著性差異(P>0.05)；模型組大鼠興趣區骨密度值顯著低于正常組大鼠興趣區骨密度(P<0.01)；姜黃素組大鼠興趣區骨密度值顯著高于模型組(P<0.01)。由此可見，大鼠造模后一定時間(28天)內整體脛骨骨密度未出現顯著性降低。而造模組大鼠脛骨遠端的骨密度出現顯著性降低，姜黃素的治療能顯著抑制AA骨密度下降，治療后骨密度與正常組無顯著性差異，詳見表1。

分組整體骨密度(g/cm2)興趣區骨密度(g/cm2)正常組 0.0709±0.00180.0701±0.0018模型組 0.0698±0.00090.0608±0.0012a姜黃素組0.0697±0.00140.0670±0.0008b

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

3.23組大鼠血清RANKL、OPG及其比值的比較

由表2可見，大鼠血清RANKL，與正常組比較，模型組、姜黃素組均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，治療組即姜黃素組顯著降低(P<0.01)。大鼠血清OPG，與正常組比較，模型組、姜黃素組均顯著降低(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組顯著升高(P<0.01)。RANKL/OPG比值，與正常組大鼠比較，模型組、姜黃素組均顯著升高(P<0.01)；與模型組比較，姜黃素組顯著降低(P<0.01)。姜黃素能夠通過改變血清RANKL及OPG的表達，來改變其比值。

表2各組大鼠血清RANKL、OPG及其比值的比較

分組RANKLOPGRANKL/OPG正常組 34.41±0.6410.47±0.383.29±0.13模型組 54.21±0.53a6.63±0.24a8.19±0.28a姜黃素組47.57±0.46ab7.52±0.23ab6.33±0.20ab

注：與正常組比較，aP<0.01；與模型組比較，bP<0.01。

4討論

RA這一病名是由英國人Garrod第一個提出的，發病后表現為小關節腫脹疼痛等炎癥癥狀，進而出現受累部位骨丟失，隨著病情進展，骨破壞加重，呈不可逆性，如未進行正規治療，2年內關節軟骨及骨的破壞可達到50%[6]。關節軟骨及骨破壞是RA的重要病理特征，而局部的骨侵蝕又是RA患者關節畸形、功能障礙的最主要原因，因此早期預防及控制骨破壞是改變RA預后的關鍵。RA的骨破壞早期表現為受累關節軟骨及骨組織由病理組織取代，進一步發展為軟骨及骨侵蝕，最終導致全身性的骨丟失，破壞關節結構。

OPG/RANKL/RANK信號途徑是免疫系統紊亂疾病(包括RA)與骨破壞之間聯系的重要通路，破骨細胞(Osteoclast，OC)是參與骨破壞的主要細胞，而OPG/RANKL/RANK系統在OC分化成熟及活性保持中起著重要作用[7]。在正常的骨重建過程中，RANKL蛋白結合RANK，促使破骨細胞的生成，保持其活性，促進骨的吸收功能。當骨的吸收大于骨的形成時，成骨細胞系自動分泌更多的OPG，假性受體競爭結合RANKL，阻止RANKL與受體RANK結合，抑制破骨細胞生成、活化，抑制骨吸收功能，使骨吸收與骨形成又處于一個相對穩定的狀態[8]。而骨丟失是RA特征性標志，其丟失程度與病情嚴重程度有關，本實驗采用DXA檢查大鼠脛骨整體及興趣區的骨密度，通過骨密度來評價AA大鼠骨丟失情況。檢查測得大鼠骨密度的情況：造模后28天，所有組大鼠的整體骨密度差異無顯著性差異。由此可見，大鼠造模后一定時間(28天)內整體脛骨骨密度并不會出現顯著降低。而脛骨遠端1 cm的骨密度即興趣區骨密度，模型組興趣區的骨密度是顯著低于正常組的。而與模型組比較，藥物干預組即姜黃素組顯著升高。姜黃素，化學結構為C21H20O6，研究發現其對免疫、細胞因子、轉錄因子具有調節作用，因此能夠產生廣泛的生物學效應。但姜黃素難以溶于水，易于溶于DMSO等有機溶劑，本實驗將姜黃素溶解于10%DMSO制成姜黃素溶液后，進行藥物干預，目的是為了讓大鼠能夠更加好的吸收姜黃素，并且同時給予模型組大鼠腹腔注射10%的DMSO，以觀察姜黃素對AA大鼠的治療作用。本實驗中觀察到在大鼠造模28天內，脛骨遠端存在著一定程度的骨丟失，姜黃素能夠抑制脛骨遠端骨密度的降低。

研究表明[9-11]諸多炎癥細胞因子(TNF-α、IL-1、IL-7、IL-17、IL-23、IL-34)能夠影響RA的炎癥及骨破壞，目前沒有有力的證據可以證明這些細胞因子能夠直接激活破骨細胞，但有證據表明絕大多數細胞因子是通過RANKL/RANK通路間接調節破骨細胞分化及活性，從而發揮作用。炎性細胞因子通過誘導成骨細胞表達RANK，結合滑膜RANKL，來激活NF-κB或JNK，增強T細胞和DC的協同作用，促進破骨細胞的分化和增殖，最終導致軟骨及骨質破壞。本實驗采用ELISA法測得大鼠血清RANKL、OPG蛋白的表達，并計算出RANKL/OPG的比值。AA模型大鼠血清RANKL表達明顯增加，OPG的表達明顯減少，RANKL/OPG的比值明顯增加，骨密度檢查，興趣區的骨密度明顯低于其它組的大鼠，進一步表明AA炎癥發生骨質破壞重要通路為OPG/RANKL通路。姜黃素干預治療AA模型大鼠后，能降低血清的RANKL的表達，提高OPG的表達，最終RANKL/OPG的比值顯著均低于模型組。因此可見，姜黃素能夠影響到外周血清RANKL、OPG的含量，最終使得RANKL/OPG的比值顯著低于模型組。由此推測，在RA治療中，姜黃素通過調控RANKL/OPG的比值，來調節OPG/RANKL系統，從而參與到抑制RA骨丟失，防止RA骨破壞。

綜上所述，姜黃素對RA具有肯定的治療作用，通過降低血清RANKL表達，提高血清OPG的表達，降低RANKL/OPG的比值，維護RA骨吸收和骨形成的動態平衡，有效預防骨質破壞，防止關節損傷，提高其骨密度，改善RA的預后。姜黃素是傳統中藥的有效提取物，具有安全性較高，價格便宜等優點，進一步研究姜黃素，可能成為治療RA的重要藥物。

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(本文編輯：董歷華)

·論著·

作者單位：100853 北京，中國人民解放軍總醫院中醫科

Effect of curcumin on the expression of blood serum osteoprotegerin and receptor activator of nuclear factor-κB ligand protein and bone mineral density in adjuvant arthritis ratsZHAOLing-jie，QIUYan，SHANGWei，etal.DepartmentofIntegratedTraditionalandWesternMedicine，NanjingGeneralHospitalofNanjingMilitaryRegion，Nanjing210002，China

【Abstract】ObjectiveBy observing the effects of curcumin on blood serum osteoprotegerin (OPG) and receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) protein and bone mineral density of adjuvant arthritis (AA) rat models, we try to explore the possible mechanism of curcumin preventing bone destruction in rheumatoid arthritis. Methods30 SD rats were randomly divided into model group, curcumin group and normal group. On day 28 draw blood from abdominal aorta to detect the expression of blood serum RANKL and OPG protein by ELISA method. After drawing blood, rats were sacrificed and stripped the right tibia, to examine bone density. Results(1) Compared with the normal group, the serum RANKL of model group and curcumin group rats were significantly increased (P< 0.01), the serum OPG expression were significantly decreased (P< 0.01), the ratio of RANKL/OPG were significantly increased (P< 0.01); (2) Compared with the model group, the serum RANKL of curcumin group was significantly decreased (P< 0.01), the serum OPG was significantly increased (P< 0.01), the ratio of RANKL/OPG was significantly decreased (P< 0.01); (3) There are no significant differences among the 3 groups’ tibia bone mineral density (P> 0.05). The bone mineral density in region of interest of curcumin group was significantly higher than that of the model group (P< 0.01). ConclusionsCurcumin has a good therapeutic effect on AA rats. Curcumin regulates the expression of blood serum RANKL and OPG, thus regulate the OPG/RANKL pathway, thereby improve bone mineral density in AA rats to inhibit the bone loss.

【Key words】Curcumin;Adjuvant arthritis;Bone mineral density;Osteoprotegerin;Receptor activator of nuclear factor-kappa B ligand

作者簡介：竇永起(1965- )，碩士，主任醫師，教授，博士生導師。研究方向：中西醫結合防治惡性腫瘤。E-mail:dyqi_301@yeah.net

(收稿日期：2014-05-14)

Corresponding author：ZHAO Ling-jie，Email：zhaolingjie68@163.com

【中圖分類號】R593.22

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1674-1749.2015.03.013