雙向薄層色譜法分析混合糖組分

劉秀花, 崔孟岐, 王莉, 張淑紅，宋兆齊,，梁峰

(1.商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘， 476000;2.商丘師范學院 生命科學學院，河南 商丘， 476000)

雙向薄層色譜法分析混合糖組分

劉秀花1,2, 崔孟岐2, 王莉2, 張淑紅1,2，宋兆齊2,1，梁峰1

(1.商丘師范學院 生物精煉河南省工程實驗室，河南 商丘， 476000;2.商丘師范學院 生命科學學院，河南 商丘， 476000)

薄層色譜法分析糖類混合物的組分簡便快速，但是并不能將甘露糖、阿拉伯糖、半乳糖、木糖、葡萄糖進行徹底分離.本文采用雙向層析的方法分別以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑優化層析.結果顯示，得到了較好的分離效果，可以定性檢測出糖類組分.對比國內外研究，此方法簡單，因此雙向薄層色譜法可以作為一種簡單、準確、清晰、便利的方法定性檢測糖類混合物的組分.

薄層色譜法；生物質；展層劑；糖類；

近年來，為應對國際能源供需矛盾，全球氣候變化等挑戰，越來越多的國家將發展生物質能作為替代化石能源、保障能源安全的重要戰略措施，積極推進生物質能開發利用.隨著國際石油市場供應緊張和價格上漲，發展生物燃料乙醇和生物柴油等生物液體燃料已成為替代石油燃料的重要方向.目前，以甘蔗、玉米和薯類作物為原料的燃料乙醇和以植物油脂為原料的生物柴油在歐洲已實現大規模應用.我國生物質能利用技術和裝備處于起步階段，仍未掌握關鍵技術而且生物柴油生產技術應用水平還不高，生物質能利用水平低，轉化效率有待提高.

生物質利用的一個主要障礙是缺乏對植物細胞壁有效的預處理，以便碳水化合物可以隨后被水解成糖來發酵成燃油或化學品[1].糖類是自然界存在數量最多的有機化合物，不僅是生物體的結構成分，也是生物體內的主要能源物質，跟植物體內的新陳代謝有密切聯系，分離檢測各種生物質降解液可溶性糖的種類，有助于對生物質轉化為生物柴油的工藝優化研究.

對比國內外研究，糖類的分離一般采用高效液相色譜或是離子交換色譜，薄層層析，展開劑種類雖然很多，在多展層劑的薄層色譜測定中，雖然大多數糖能被一次性分離[2-6]，但是像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖這樣的分解液中常有的糖類卻總是因為Rf值相近而無法分離完全.因此,本實驗通過對比多種展層劑的展層效果，運用雙向層析，增加展距，提高了分離能力，從而得以分析出糖類混合物組分.

1 材料和方法

1.1 材料

薄層層析硅G型、乙酸乙酯，正丁醇，丙酮，無水乙醇，乙腈，磷酸，苯胺，二苯胺，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖均為分析純級試劑，蒸餾水.

1.2 方法

1.2.1 標準糖液的配制

分別配制D-木糖、D-甘露糖、D-葡萄糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-蔗糖、七葉苷、L-鼠李糖，麥芽糖、α-乳糖等1%的乙醇溶液.選取D-甘露糖、L-阿拉伯糖、D-半乳糖、D-木糖、D-葡萄糖等5種溶液，配制0.25%的混合糖液A.選取上述10種溶液配制0.25%的混合糖液B，保存于4℃冰箱中待用.

1.2.2 展層劑的配制

按照展層劑的配方，將量取好的各種展層液混合在一起，置于層析缸中，溫度控制在4～9 ℃左右.展層劑高度不超過1cm.讓展開劑的蒸氣充滿層析缸，為防止邊沿效應，飽和時間在0.5 h左右. 使用的展層劑如表1：

表1 糖的薄層色譜使用的展層劑體系

注:展層劑體系的試劑的比例均是體積比

1.2.3 薄層層析

選取20 cm×20 cm和10 cm×20 cm層析板，0.25%羧甲基纖維素鈉水溶液作為黏合劑，取硅膠 4 g與12 mL的0.25%羧甲基纖維素鈉水溶液混合研磨涂布制板，過程采用自然流動混合均勻法，水平靜置自然風干. 使用前將薄層板置于105℃烘箱內活化30 min，置于干燥器中備用.

第一向展開，把配制好的展層劑1倒入層析缸中，放在4～9℃層析柜中進行飽和30 min，點好樣層析，當溶劑前沿擴展到層析板上端約1～2 cm處時，取出板并晾干.第二向展開，待層析板晾干后，順時針旋轉90°，放在展層劑2進行第二步層析，當溶劑前沿擴展到距薄層板上端約1～2 cm處時，取出板并晾干.

1.2.4 顯色

苯胺-二苯胺-磷酸顯色劑：取50 mL丙酮置于燒杯中，依次加入5 mL 85%磷酸，1 mL苯胺和1 g二苯胺，磁力攪拌器加熱，直至均勻無顆粒.將顯色劑均勻噴灑板上， 85 ℃烘箱加熱10 min左右顯色.

2 結果與分析

2.1 單向層析對單糖分離的效果

本實驗以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為展層劑，以單向層析對D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種單糖及其混合液進行分離，結果如下圖1：

點樣：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖，6.混合糖液1

Figure 1 developing solvent 2 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose , 6.solution 1圖2 展層劑1對糖分離效果圖譜(展層劑為V乙腈∶V水=85∶15)

點樣：1.D-甘露糖，2.L-阿拉伯糖，3. D-半乳糖，4.D-木糖，5.D-葡萄糖

Figure 2 developing solvent 1 on the separation of sugar Sample point sequence: 1.D-mannose, 2 .L- Arabia sugar, 3.D- galactose , 4.D- xylose , 5. D- glucose .

從圖1可以看出，在展層劑為：V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1進行分離的結果較為清晰，但是由于D-葡萄糖，L-阿拉伯糖的Rf值相近，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖層析結果顯示重合在一條水平層析帶上，并不能將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通過單向層析一次性徹底分離.這為薄層層析分析糖類混合物的組分帶來不便，不能有效對各種糖類降解液、混合糖液進行組分分析優化研究.

為了將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖通過薄層層析徹底分開，反復對比不同展層劑的分離效果，以V乙腈∶V水=85∶15為展層劑進行層析分離時，結果如圖2.

從圖2可以看出，在以V乙腈∶V水=85∶15為展層劑對D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖進行薄層層析分離時，可以將L-阿拉伯糖和D-葡萄糖分開，但是D-甘露糖和D-葡萄糖層析結果在水平方向有重合，因此，V乙腈∶V水=85∶15這種展層劑液不能將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖分離完全.

2.2 雙向層析對單糖混合物分離的效果

從圖1可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖因為Rf值太近在單向層析時，很難分開；從圖2可以看出，L-阿拉伯糖和D-葡萄糖雖然Rf值較為接近，但是仍然是可以通過特定展層劑層析分離開.這是由單向層析展距的局限性決定的，為了擴大展距，增強分離能力，需要以雙向層析進行分離.

因此，為了薄層層析將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種糖徹底分離，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，在展層結束后，順時針旋轉90°，又以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑，進行了雙向層析，如圖3.

從圖3，可以看出，在以V乙腈：V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇：V乙酸乙酯：V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向層析時，展距擴大，增強了分離能力，D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖得以徹底分離，從而達到了通過薄層層析對混合糖進行分離的效果，對于定性研究糖類混合物的組分有重大的意義，木糖因為層析的作用強，經過雙向層析位于右上角，而半乳糖位于左下角，阿拉伯糖則能夠與葡萄糖分開，略微靠右.

相對于國內之前的研究，雙向層析將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖這5種單糖混合物徹底分開，得到了清晰、直觀的層析結果，準確定性糖類混合物的組分.

2.3 雙向層析對多種混合糖的分離效果

從圖3可以看出，雙向層析對單糖混合物分離結果比較清晰，由于具備較強的展開能力，雙向層析可以將單糖的混合物進行分離，為了驗證雙向層析的實用性，本次試驗共采用D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖共10種糖，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向層析，結果如圖4.

如圖4所示，以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1第二向展層劑雙向層析對10種糖類混合物進行分離，得到了較好的分離結果，相對于同類研究，雙向層析是一種簡單快速的層析方法，由于混合糖的組分復雜以及雙向展開時薄層板的活度急劇下降等因素的影響，雖然可以成功分離開，但是未能獲得清晰圖像，后續還有待研究，繼續進行優化.

3 結 論

前人研究表明，糖類混合物的組分鑒定一般采用高效液相色譜或是離子交換色譜，對技術要求較高、成本較高，但結果比較精確.薄層層析方法較簡便，效果顯現快，對較為粗略的測定是一種可選的方法.但有些糖類，比如像D-葡萄糖，L-阿拉伯糖等在植物降解液常有的糖類卻總是因為Rf值相近而無法完全分離.通過對比研究不同展層劑的分離效果，本實驗最終確立以V乙腈∶V水=85∶15為第一向展層劑，以V正丁醇∶V乙酸乙酯∶V水=7∶2∶1為第二向展層劑的雙向層析分離體系，同時以苯胺-二苯胺-磷酸為顯色劑，效果比較理想，不僅將D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖組成的單糖混合物徹底分開.在增加多種糖的前提下，雙向層析對D-木糖，D-甘露糖，D-葡萄糖，L-阿拉伯糖，D-半乳糖，D-蔗糖，七葉苷，L-鼠李糖，麥芽糖，α-乳糖這10種混合糖液進行分離，也得到了較好的分離效果.因此，雙向層析可以選定為快速分析糖類混合物、植物水解液、微生物發酵液糖類組分的比較理想的分離體系.

本實驗通過對多種糖類混合物的層析分離，為糖類混合物、植物水解液、微生物發酵液的層析分離鑒定奠定了基礎，適合于大規模生物質降解液的快速定性鑒定.通過對比薄層色譜的展層劑對糖類的分離效果建立的雙向層析，可作為一種快速、準確、便捷的測定方法快速分析糖類混合物組分.

[1] Ke J,LaskarDD,Gao D,Chen S. Advanced biorefinery in lower termite-effect of combined pretreatment during the chewing process [J]. Biotechnol Biofuels.2012 Mar 5;5(1):11. doi: 10.1186/1754-6834-5-11.

[2] 劉秀花，王莉，張淑紅，等. 玉米芯降解液糖類成分薄層色譜法分析技術優化[J].商丘師范學院學報，2014,30(9):55-59.

[3] 張桂，李俊英，陳學武，等.薄層層析法測定纖維素材料水解液中混合糖的研究[J].理化檢驗-化學分冊，2002,38(2)：81-82,84.

[4] 方琳.姚帥.崔亞君，等. 二維薄層色譜技術的研究進展[J].中成藥，2014，36(3)：589-592.

[5] 張麗芝.單糖組成分析方法的研究進展[J].微生物學免疫學進展，2013,41(1)：77-81.

[6] 姜曉滿，田衛，張海霞，等，糖類物質的色譜分析[J].藥物分析雜志，2006,26(8)：1181-1186.

[責任編輯：徐明忠]

·學術動態·

湖南師范大學博士生導師謝青季教授蒞臨我校講學

2015年4月14日，應我校化學化工學院邀請，湖南師范大學“化學生物學及中藥分析”教育部重點實驗室主任、博士生導師謝青季教授來到我校，在文化路校區化學實驗樓311室作了題為“金屬標記的高敏安培生物分析”的學術報告.報告會由化學化工學院院長趙文獻教授主持，化學化工學院部分師生聆聽了報告.

謝青季教授首先從“核外電子運動”、“價電子轉移的有效距離”和“金屬標記型生物電化學分析”三個方面介紹了他的課題組開展相關科研工作的研究背景.隨后，謝教授分別介紹了他的課題組在“納米硫化鎘標記的免疫和核酸適體高敏分析”、“基于金標銀染和原電池置換反應的高敏免疫分析”以及“基于金標金染的高敏免疫分析”方向的最新研究成果，并與化學化工學院的教師們進行了深入的學術交流.

謝教授語言幽默、邏輯清晰，研究背景貼近生活，研究內容新穎前沿.本場精彩的學術報告讓大家受益匪淺，博得了與會師生的陣陣掌聲，尤其謝教授的課題組在阻抗分析式石英晶體微天平方面的創新性研究工作博得了在場師生的一致贊許.會后，謝教授與我校“生物分子識別與傳感重點實驗室”的科研人員就研究生培養及專業方向的一些學術問題進行了討論和交流.

謝青季，博士，教授，湖南師范大學博士生導師、武漢大學分析化學專業校外博士生導師，化學生物學及中藥分析省部共建教育部重點實驗室主任(湖南師范大學)、湖南省分析化學重點學科學術帶頭人.主持國家自然科學基金、國家重大基礎研究計劃前期研究專項、全國高校優秀青年教師教學科研獎勵計劃、教育部骨干教師資助計劃和湖南省杰出青年基金等課題.已在Anal. Chem.、Adv. Funct. Mater.、J.Phys.Chem.B等學術期刊發表SCI收錄論文90余篇.曾獲首屆全國高校優秀青年教師獎、中國化學會青年化學獎、省部級科技進步獎二等獎和湖南省教學成果獎一等獎等獎勵，享受國務院政府特殊津貼.

Two-step thin layer chromatography for saccharides analysis of mixed saccharides liquid

LIU xiuhua1,2,CUI mengqi2, WANG li2, ZHANG Shuhong1,2，SONG Zhaoqi2,1， LIANG feng1

(1.Biorefinery Engineering Lab of Hena Province, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China;2.Department of Life Science, Shangqiu Normal University, Shangqiu 476000, China)

The thin layer chromatography(TLC)analysis of the mixed saccharides liquid composition effect is good, simple and rapid, but it doesn′t put the mannose, arabinose, galactose, xylose, glucose separately. This paper using the two step-TLC, the first step byVacetonitrile∶Vwater=85∶15，and the second step byVn-butanol∶Vethyl acetate∶VWater=7∶2∶1 as developing solvent for optimization of chromatography. Results show that using the above method to analyze saccharides mixture, got the good separation effect, can the qualitative detection of saccharides components, comparative research both at home and abroad, the use effect of the method is very simple and intuitive. Therefore, the two step thin layer chromatography(TLC)can be used as a simple, accurate, clear and convenient method of qualitative detection of saccharide mixture components.

TLC;biomass;developing solvent;saccharides;

2015-03-16

河南省重點科技攻關資助項目(132102310039,142102310044);河南省教育廳自然科學研究項目(13A180830)

劉秀花(1963-),女，河南新鄉人，商丘師范學院教授，主要從事微生物資源、酶制劑、生物能源方面的研究.

O657.7

A

1672-3600(2015)06-0069-05