阿托伐他汀緩解百草枯中毒大鼠肺纖維化機制的研究

龔曉亮，樊菲菲，王彥軍，黃　楊，尹　文

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阿托伐他汀緩解百草枯中毒大鼠肺纖維化機制的研究

龔曉亮，樊菲菲，王彥軍，黃楊，尹文

[摘要]目的觀察阿托伐他汀對百草枯中毒所致肺纖維化療效，并探討其可能的作用機制。方法取健康成年SD大鼠120只，隨機分為生理鹽水組和百草枯組，每組10只，百草枯+阿托伐他汀10、20、40 mg組(實驗1、2、3組)，百草枯+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮組(PLZ組)和百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662組(GW9662組)，每組20只。百草枯肺間質纖維化模型以百草枯溶液3.5 mg/kg的劑量腹腔注射制備，生理鹽水組則以等體積的生理鹽水腹腔注射，其余各藥物干預組均在建立百草枯模型的基礎上給予相應的藥物，連續給藥14 d后處死大鼠，比較各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞數目、肺組織中羥脯氨酸、血清中轉化生長因子(TGF)-β1的含量。結果肺泡灌洗液中炎性細胞數目、肺組織中羥脯氨酸、血清中TGF-β1的含量百草枯組均高于生理鹽水組，實驗2、3組均低于百草枯組(P<0.05，P<0.01)。GW9662組肺泡灌洗液中炎性細胞數目和肺組織中羥脯氨酸低于實驗3組，PLZ組高于實驗3組(P<0.05，P<0.01)。GW9662組和PLZ組血清中TGF-β1的含量均高于實驗3組，但PLZ組升高更明顯(P<0.05，P<0.01)。結論阿托伐他汀可緩解百草枯中毒所致的肺纖維化，且呈劑量依賴的方式，其作用機制可能是通過PPARγ途徑而實現。

[關鍵詞]百草枯；中毒；肺纖維化；阿托伐他汀；吡格列酮；GW9662；PPARγ；大鼠，Sprague-Dawley

百草枯是目前使用最廣泛的速效觸殺型除草劑[1]。由于百草枯中毒機制尚未完全清楚，故缺乏特異性的解毒劑。有報道，常規清除毒素、血液凈化、清除氧自由基、免疫抑制劑聯合治療后致死率仍為25%～80%[2]。百草枯所致肺組織損傷機制目前并不完全清楚，但百草枯在結構方面類似于內生性多胺，易被肺組織及氣管主動攝取，在肺部蓄積[3-5]，從而導致肺間質纖維化及呼吸衰竭。所以，明確百草枯中毒后肺間質纖維化發生的機制，將成為百草枯中毒救治的關鍵。有學者研究表明，肺間質纖維化與各種炎性因子的浸潤和氧化應激相關[6-7]。阿托伐他汀已在動物實驗方面證實了其可通過作用于A羥甲基戊二酰輔酶A(HMG CoA)還原酶而發揮抗炎及抗纖維化作用[8-9]，故我們設計本實驗以驗證阿托伐他汀是否具有緩解百草枯中毒所致的肺纖維化的作用，并探討其可能的作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物及分組選用健康成年SD大鼠120只，體重(250±50)g，由第四軍醫大學動物實驗中心提供。實驗前大鼠禁食12 h，可自由活動及飲水。隨機分為生理鹽水組和百草枯組各10只，百草枯+阿托伐他汀10、20、40 mg組(實驗1、2、3組)，每組20只，百枯草+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮組(PLZ組)和百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662組(GW9662組)各20只，2 d稱重大鼠1次，根據大鼠體重調整進食水及用藥劑量。

1.2主要儀器和試劑流式細胞儀(美國BD公司FACSAria產品)，雙光束紫外分光光度計(上海天美科學儀器有限公司)，羥脯氨酸檢測試劑盒(南京建成生物工程研究所)；轉化生長因子(TGF)-β1(1∶200)蛋白兔抗人多克隆抗體(美國Santa Cruz公司)，Trizol試劑盒(美國Invitrogen公司)，SP檢測試劑盒(北京中杉金橋公司)，百草枯溶液(北京華都生物科技有限公司)，阿托伐他汀(大連輝瑞制藥有限公司)，吡格列酮(Sigma-Aldrich公司)，GW9662(Tocris bioscience公司)。

1.3模型制備百草枯肺間質纖維化模型以百草枯溶液3.5 mg/kg的劑量腹腔注射制備，生理鹽水組則以等體積的生理鹽水腹腔注射，其余各藥物干預組均在建立百草枯模型的基礎上給予相應的藥物處理。實驗組給予不同劑量阿托伐他汀水溶液灌胃，PLZ組和GW9662組分別于腹腔注射吡格列酮10 mg/kg和GW9662 1 mg/kg[10]，所有藥物每日給藥1次，給藥14 d后處死所有大鼠。

1.4觀察指標

1.4.1肺泡灌洗液中炎性細胞的收集：用25%的烏拉坦麻醉處死大鼠，分離氣管和雙肺，切開氣管插入塑料管，用15 ml生理鹽水反復灌洗肺泡，紗布過濾后收集灌洗液，取相同體積的灌洗液，計數中性粒細胞、單核細胞、淋巴細胞、巨噬細胞數量。

1.4.2肺組織中羥脯氨酸水平的測定：肺組織標本溶解在氯化鉀溶液(pH=7.4)150 ml中，混合物用來測量羥脯氨酸含量，0.5 ml的標本溶解在6 mol/L的氯化鉀溶液1 ml中，130℃，水解5 h，然后用NaOH調節混合液pH為6.5～7.0，加入雙蒸水至30 ml，搖勻后取樣品1 ml和0.05 mol/L氯胺T 1.0 ml混合，室溫孵育20 min，然后加入20%的二甲苯1 ml溶解，混合物在60℃孵育20 min，最后用分光光度計測量樣品在550 nm處的吸光度值，與試劑盒中羥脯氨酸標準品對應的吸光度值比較，計算出各組大鼠肺組織中羥脯氨酸含量。

1.4.3血清中TGF-β1的測定：大鼠左心室采血1 ml，將標本酸化后與標準品混合，加入被抗人TGF-β1單抗包被的酶標板上，室溫放置2 h，PBS洗滌4次，加入生物素化的抗人TGF-β1抗體，室溫放置2 h，PBS洗滌4次，加入酶標抗體30 min，PBS洗滌4次，加入底物A、B液顯色5～15 min，加入終止液，酶標儀450 nm比色，與標準品對應的比色值比較，計算出各組血清中TGF-β1含量。

2結果

2.1肺泡灌洗液中炎性細胞含量肺泡灌洗液中炎性細胞含量百草枯組均高于生理鹽水組(P<0.01)，實驗1組與百草枯組比較差異無統計學意義(P>0.05)，實驗2、3組均低于百草枯組，GW9662組低于實驗3組，PLZ組高于實驗3組(P<0.05，P<0.01)。見表1。

2.2肺組織中羥脯氨酸的含量肺組織中羥脯氨酸含量生理鹽水組、百草枯組、實驗1、2、3組、GW9662組和PLZ組分別為(1.7±0.1)、(5.9±0.3)、(4.8±0.8)、(4.5±0.3)、(3.2±0.1)、(2.2±0.4)和(4.1±0.9)mg/g，百草枯組含量高于生理鹽水組(P<0.05)，實驗1組與百草枯組比較差異無統計學意義(P>0.05)，實驗2、3組低于百草枯組(P<0.05，P<0.01)，GW9662組低于實驗3組，PLZ組高于實驗3組(P<0.05)。

表1　各組大鼠肺泡灌洗液中炎性細胞的數目(×106/L)

注：實驗1、2、3組分別給予阿托伐他汀10、20、40 mg, GW9662組為百枯草+阿托伐他汀40 mg+GW9662組，PLZ組為百枯草+阿托伐他汀40 mg+吡格列酮組；與生理鹽水組比較，bP<0.01；與百草枯組比較，aP<0.05，dP<0.01；與實驗3組比較，cP<0.05，fP<0.01

2.3血清TGF-β1的含量血清TGF-β1的含量生理鹽水組、百草枯組、實驗1、2、3組、GW9662組和PLZ組分別為(4.5±1.1)、(21.5±5.7)、(18.2±6.2)、(11.3±2.6)、(3.2±0.1)、(6.1±2.5)和(9.8±2.5)ρB/(ng·ml)，百草枯組含量高于生理鹽水組(P<0.05)，實驗1組與百草枯組比較差異無統計學意義(P>0.05)，實驗2、3組低于百草枯組(P<0.05，P<0.01)，GW9662組和PLZ組均高于實驗3組，但PLZ組升高更明顯(P<0.05，P<0.01)。

3討論

本研究結果發現，經過14 d百草枯處理后的大鼠出現了肺間質纖維化及炎性細胞的浸潤，與以往研究結果相符[10-11]。百草枯可誘導肺間質纖維化，但其確切的分子機制及細胞內作用位點并不清楚，有學者研究表明其機制可能是過氧化應激負荷的加重[6]，也有學者研究表明，百草枯可通過消耗硫醇分子而使細胞內抗氧化分子減少，從而削弱細胞的抗氧化能力[7]。肺間質纖維化最主要的病理學改變是細胞外基質的增多和肺泡間結締組織的增生、重建，細胞外基質中含有豐富的Ⅲ、Ⅳ型膠原蛋白。已有研究結果表明，羥脯氨酸在其他膠原蛋白中的含量約1%，而在Ⅳ型膠原蛋白中含量高達13%[12]，故羥脯氨酸的含量可間接反映肺纖維化的水平，而在本實驗中也發現了經百草枯誘導后其含量顯著升高，經阿托伐他汀干預后其含量下降。TGF-β1是被公認的最關鍵的導致纖維化的炎性因子[13-14]。TGF-β1可能通過增加成纖維細胞及細胞外基質的蓄積而產生炎性作用，成纖維細胞及細胞外基質的增多，可能導致間質纖維化的產生及惡化，故TGF-β1也可作為肺纖維化的一個指標。本研究結果顯示，百草枯組血清TGF-β1的含量顯著高于生理鹽水組，而阿托伐他汀20、40 mg干預后，其含量較百草枯組顯著下降。

近年來研究表明，PPARs在動脈粥樣硬化等炎性反應中起重要作用[9]，而PPARs，尤其是PPARγ作為近年來炎性反應研究的熱點，在肺部慢性炎性疾病中也起重要作用，PPARγ和PPARα的配體可減少炎性細胞的募集、細胞外基質的產生及膠原蛋白的降解[15-16]。既往研究結果顯示，阿托伐他汀具有抗炎、抗纖維化和抑制細胞外基質聚集及促進其分解等作用[17]。已知吡格列酮是PPARγ的激活劑，GW9662是PPARγ的抑制劑，可抑制PPARγ的活性。本研究結果表明，實驗2、3組中炎性細胞數量、肺纖維化的指標均明顯下降，而實驗3組下降更明顯；GW9662組炎性細胞數量和羥脯氨酸低于實驗3組，PLZ組均高于實驗3組，GW9662組和PLZ組TGF-β1均高于實驗3組，但PLZ組升高更明顯，因此，本實驗謹慎得出，阿托伐他汀可緩解百草枯中毒所致的肺纖維化，而加入PPARγ抑制劑GW9662后可使這種保護作用放大，加入PPARγ激活劑后可部分逆轉這種保護作用，繼而推斷出阿托伐他汀對百草枯中毒所致肺纖維化的保護作用可能是通過PPARγ途徑實現的。

綜上所述，阿托伐他汀對百草枯中毒所致肺纖維化的保護作用呈劑量依賴性，抑制PPARγ途徑可增強阿托伐他汀對肺纖維化的保護作用，而激活PPARγ途徑可能降低阿托伐他汀對肺纖維化的保護作用。阿托伐他汀是治療百草枯中毒所致肺纖維化極有前景的藥物，其是否能最終在臨床得以推廣，目前仍缺乏臨床數據的驗證，而其他他汀類藥物是否具有相同的保護作用亦有待驗證。

[參考文獻]

[1]劉建青，白家磊，孫思明，等.百草枯完全抗原及多克隆抗體的制備[J].解放軍預防醫學雜志,2014,32(4):292-295.

[2]孫國慶，孫昊，呂清泉，等.百草枯中毒患者肝功能損害及血液凈化治療對預后的影響[J].世界華人消化雜志，2012,20(36):3782-3786.

[3]van der Wal N A, van Oirschot J F, van Dijk A,etal. Mechanism of protection of alveolar type II cells against paraquat-induced cytotoxicity by deferoxamine[J].Biochem Pharmacol， 1990，39(11):1665-1671.

[4]Kuter K, Smiaowska M, Wierońska J,etal. Toxic influence of subchronic paraquat administration on dopaminergic neurons in rats[J].Brain Res,

[5]Li Z, Yang J, Yu G,etal. Water-soluble pillar arene: synthesis, pH-controlled complexation with paraquat, and application in constructing supramolecular vesicles[J].Org Lett, 2014,16(7):2066-2069.

[6]Kim Y S, Zerin T, Song H Y. Antioxidant action of ellagic acid ameliorates paraquat-induced A549 cytotoxicity[J].Biol Pharm Bull, 2013,36(4):609-615.

[7]Kuter K, Nowak P, Goembiowska K,etal. Increased reactive oxygen species production in the brain after repeated low-dose pesticide paraquat exposure in rats. A comparison with peripheral tissues[J].Neurochem Res, 2010,35(8):1121-1130.

[8]Mun J H, Kim Y M, Kim B S,etal. Simvastatin inhibits transforming growth factor-β1-induced expression of type I collagen, CTGF, and α-SMA in keloid fibroblasts[J].Wound Repair Regen, 2014,22(1):125-133.

[9]Malekinejad H, Mehrabi M, Khoramjouy M,etal. Antifibrotic effect of atorvastatin on paraquat-induced pulmonary fibrosis: role of PPARγ receptors[J].Eur J Pharmacol, 2013,720(1-3):294-302.

[10]吳天瓊,葉更新.百草枯中毒肺損傷的治療前后CT表現特征與預后相關性分析[J].中國醫藥科學,2013,3(22):100-102.

[11]王言理,劉克喜,李小民,等.烏司他丁對百草枯中毒大鼠肺損傷的影響[J].中華臨床醫師雜志,2014(10):1900-1904.

[12]張云,王琰,何亞榮,等.蒙脫石聯合甘露醇對百草枯急性中毒大鼠早期肺間質纖維化的影響[J].重慶醫學,2013(33):4059-4061.

[13]Kan B, Jian X, Zhou Q,etal. Effect of transforming growth factor-β1on acute lung injury caused by paraquat[J].Mol Med Rep, 2014,9(4):1232-1236.

[14]Shao X, Li M, Luo C,etal. Effects of rapamycin against paraquat-induced pulmonary fibrosis in mice[J].J Zhejiang Univ Sci B, 2015,16(1):52-61.

[15]Hsu W H, Lee B H, Pan T M. Monascin attenuates oxidative stress-mediated lung inflammation via peroxisome proliferator-activated receptor-gamma (PPAR-γ) and nuclear factor-erythroid 2 related factor 2 (Nrf-2) modulation[J].J Agric Food Chem, 2014,62(23):5337-5344.

[16]Nagao S, Yamaguchi T. PPAR-γ agonists in polycystic kidney disease with frequent development of cardiovascular disorders[J].Curr Mol Pharmacol, 2012,5(2):292-300.

[17]Bellosta S, Ferri N, Arnaboldi L,etal. Pleiotropic effects of statins in atherosclerosis and diabetes[J].Diabetes Care, 2000,23(Suppl 2):B72-78.

(收稿時間：2014-12-16修回時間：2015-01-27)

基礎研究

·論著·

A Mechanisms Study on Atorvastatin in Alleviation of Pulmonary Fibrosis Rats with Paraquat Poisoning

GONG Xiao-liang, FAN Fei-fei, WANG Yan-jun, HUANG Yang, YIN Wen (Emergency Department, Xijing Hospital of the Fourth Military Medical University of PLA, Xi'an 710032, China)

[Abstract]ObjectiveTo observe the curative effects of Atorvastatin on Paraquat (PQ)-induced pulmonary fibrosis and to explore the possible mechanisms. MethodsA total of 120 healthy adult SD rats were randomly divided into normal saline group (n=10), PQ poisoned group (n=10), PQ and Atorvastatin at the dose of 10, 20 or 40 mg groups (experiment group 1, 2 and 3,n=20 for each group), PQ, Atorvastatin at the dose of 40mg and Pioglitazone group (PLZ group,n=20) and PQ, Atorvastatin at the dose of 40mg and GW9662 group (GW9662 group,n=20). The PQ-induced pulmonary fibrosis models were established with 3.5 mg/kg PQ solutions by intraperitoneal injection, and the models of normal saline group were established with the same volume of normal saline by intraperitoneal injection. All the drug intervention groups were given corresponding drugs after the establishment of PQ models, and all the SD rats were sacrificed at the 14thd of continous administration, and then the amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid, the content of hydroxyproline in lung tissues and the content of serum TGF-β1(transforming growth factor-β1) among all groups were compared. ResultsThe values of amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid, the content of hydroxyproline in lung tissues and the content of serum TGF-β1in PQ poisoned group were significantly higher than those in normal saline group, and the values in experiment group 2 and 3 were less significant than those in PQ group (P<0.05，P<0.01). The values of amount of inflammatory cells in alveolar lavage fluid and the content of hydroxyproline in lung tissues in GW9662 group were less significant than those in experiment group 3, while the values in PLZ group were significantly higher than those in experiment group 3 (P<0.05，P<0.01). The values of serum TGF-β1content in PLZ group and GW9662 were significantly higher than that in experiment group 3, but the increased value was more obvious in PLZ group (P<0.05，P<0.01). ConclusionAtorvastatin can alleviate the PQ-induced pulmonary fibrosis with a dose-dependent manner, and the mechanisms may be achieved through PPARγ.

[Key words]Paraquat； Poisoning; Pulmonary fibrosis; Atorvastatin; Pioglitazone; GW9662; PPAR gamma; Rats, Sprague-Dawley

[DOI]10.3969/j.issn.2095-140X.2015.05.007

[文獻標志碼][中國圖書資料分類號]R595.5A

[文章編號]2095-140X(2015)05-0023-03

[通訊作者]尹文，E-mail：xjyyyw@fmmu.edu.cn

[基金項目][作者單位]710032 西安，第四軍醫大學西京醫院急診科