電刺激小腦頂核對腦缺血再灌注后大鼠腦組織損傷的影響及其機制

何蘭英，羅勇，王健，董為偉

電刺激小腦頂核對腦缺血再灌注后大鼠腦組織損傷的影響及其機制

何蘭英1，羅勇2,3，王健1，董為偉2,3

[摘要]目的探討電刺激小腦頂核對大鼠局灶腦缺血再灌注后腦保護作用的機制。方法Sprague-Dawley大鼠分為正常對照組(NC組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血再灌注后小腦頂核刺激組(FNS組)、毀損小腦頂核組(FNL組)，后3組根據再灌注時間分為7 d和14 d兩個亞組，每個亞組6只。大腦中動脈線栓法制作缺血再灌注模型。相應時間點采用Western blotting檢測腦梗死周圍組織核因子-κB (NF-κB) P50蛋白表達，逆轉錄-聚合酶鏈反應法(RT-PCR)檢測腫瘤壞死因子-α(TNF-α)和Bcl-xL mRNA表達，同時檢測各組腦梗死體積。結果與I/R組比較，FNS組NF-κB P50蛋白表達各時間點均增高(P<0.05)，TNF-α mRNA表達明顯降低(P< 0.01)，Bcl-xL mRNA表達升高(P<0.05)，梗死面積明顯減少(P<0.01)。與I/R組比較，FNL組上述指標均無顯著性差異(P>0.05)。結論FNS可有效提高腦缺血再灌注后NF-κB P50蛋白、Bcl-xL mRNA表達，抑制下游炎癥因子TNF-α mRNA的表達，減小腦梗死體積，可能是FNS發揮中樞神經保護的機制之一。

[關鍵詞]腦缺血再灌注損傷；電刺激；小腦頂核；核因子-κB；腫瘤壞死因子-α；Bcl-xL；大鼠

[本文著錄格式]何蘭英，羅勇，王健，等.電刺激小腦頂核對腦缺血再灌注后大鼠腦組織損傷的影響及其機制[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(9): 1012-1015.

CITED AS: He LY, Luo Y, Wang J, et al. Effect of electrical stimulation to cerebellar fastigial nucleus on cerebral ischemia-reperfusion injury in rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1012-1015.

缺血性腦血管病是引起人類死亡的第二大疾病，也是導致功能殘疾的最常見疾病。腦缺血再灌注后可引起一系列反應，導致神經細胞損傷和死亡，包括一氧化氮合成，興奮性氨基酸、炎癥介質、氧自由基生成，線粒體損傷，細胞程序性死亡以及膠質細胞激活[1-3]。某些治療可以增加神經細胞對缺血的耐受性，或減輕再灌注損傷，延長治療時間窗，提高再灌注損傷治療的有效性。目前，針對上述機制研發了多種神經保護劑，但這些神經保護劑用于臨床試驗時，大多因無效或不良反應而被提前終止。

近年研究證明，電刺激小腦頂核(fastigial nucleus stimulation, FNS)對中樞神經具有廣泛的保護作用，能抑制炎癥因子的產生，抑制神經細胞凋亡，促進神經再生，促進神經結構和功能重建等[4-7]。本研究探討FNS神經保護作用的機制。

1　材料與方法

1.1主要試劑和設備

兔抗鼠核因子-κB (factor-kappa B, NF-κB) P50多克隆抗體(SC-114)、多克隆兔抗鼠內參β-actin抗體(SC-130657)：SANTA CRUZ公司。蛋白Marker：Fermentas公司。PVDF膜：美國ROCHE公司。總RNA提取試劑盒：上海華舜生物工程有限公司。SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液(5×)、SDS-PAGE凝膠配制試劑盒：碧云天生物技術研究所。RT-PCR試劑盒：大連寶生物。Gel Doc 2000凝膠成像儀、PCR儀：Bio-Rad公司。高速冷凍離心機：BECKMAN公司。紫外分光光度儀：GENEQUANT公司。

1.2實驗動物

健康成年雄性Sprague-Dawley大鼠，體質量250～ 300 g，重慶醫科大學實驗動物中心提供，合格證號：SCXK(渝)2007-0001。每天給予充足的食物和水，室溫22℃左右。所有實驗操作程序嚴格遵照實驗動物管理和保護的條款執行。

大鼠隨機分為正常對照組(NC組)、缺血再灌注組(I/R組)、缺血再灌注后小腦頂核刺激組(FNS組)，缺血再灌注后毀損小腦頂核組(FNL組)，后3組根據再灌注時間分為7 d和14 d兩個亞組，每個亞組6只大鼠。NC組不給予任何處理；I/R組夾閉右側大腦中動脈2 h后再灌注；FNL組為預先毀損小腦頂核5 d后再行缺血再灌注，隨后行FNS治療；FNS組為在局灶腦缺血再灌注后分別給予FNS。

術中出血較多、呼吸困難、取腦時發現蛛網膜下腔出血及提前死亡者剔除，并補足相應例數。

動物蘇醒后參考Longa等的評分法評分[8]，2分或以上者入選。

1.3FNS

參照Nakai等的方法[9]，將大鼠固定在立體定位儀上，根據大鼠腦立體定向圖譜并結合鼠的大小，確定小腦頂核的位置：以前囟后緣為0點，正中線向后11.4～11.8 mm，旁開0.8～1.0 mm，深5.2～5.7 mm。3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉。在大鼠顱骨上鉆1個孔，將同心圓電極插入右側小腦頂核。刺激參數：電流強度50 μA，頻率50 Hz，0.5 ms直角方波脈沖；持續刺激1 h。刺激過程中動物處于淺麻醉狀態。

1.4小腦頂核毀損

定位兩側小腦頂核，用0.5 μl微量注射器分別將0.2 μl鵝膏氨酸(SIGMA公司)注入兩側小腦頂核，留針5 min緩慢拔出，縫合皮膚。5 d后行腦缺血再灌注造模。

1.5梗死體積測定

每組大鼠在再灌注后7 d、14 d，以3.5%水合氯醛1 ml/100 g腹腔注射麻醉，迅速斷頭取腦。取出全腦，置4℃0.1 mol/L PBS液中，清除表面腦膜和血塊。置于-20℃冰箱中30 min。沿視交叉冠狀切片，連續7個，片厚約2 mm。1% 2,3,5-氧化三苯基甲氮唑(TTC)溶液中37℃水浴30 min。0.01 mmol/L PBS溶液沖洗3次，4%多聚甲醛浸泡6 h后觀察腦組織顏色。正常腦組織呈均勻紅色，缺血組織呈白色。采用生物醫學圖像分析系統檢測腦梗死面積，根據腦切片梗死面積及切片間距離計算梗死體積。

梗死體積=∑[(S1+S2)/2×H]

其中，S1和S2為每一切片上下兩面病灶面積，H為梗死層面厚度。

1.6Western blotting

取大鼠缺血灶周圍腦組織50 mg，剪成碎片，冰浴中玻璃勻漿器勻漿；4℃1000 g離心10 min；棄上清液，沉淀物中加蛋白裂解液500 μl，冰面上裂解30 min，4℃14000 g離心10 min，取上清液，分裝后-20℃保存。Bradford法蛋白定量。取樣品至0.5 ml離心管中，加入5×SDS- PAGE蛋白上樣緩沖液至終濃度為1×。8% SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳分離，半干電轉移法至PVDF膜，室溫下封閉液封閉1 h。分別加入1∶500多克隆兔抗鼠P50、內參β-actin多克隆兔抗鼠一抗，4℃孵育過夜。用相應的抗鼠二抗(1∶750)室溫孵育2 h，化學發光法顯色，凝膠圖像處理系統分析目標帶的分子量和凈光密度值，以其與β-actin比值作為代表其表達水平。

1.7RT-PCR

取大鼠缺血灶周圍腦組織50 mg，按試劑盒說明進行總RNA提取，RT-PCR試劑盒說明進行TNF-a和Bcl-xL mRNA表達水平的測定。引物設計：

β-actin：上游5'-GAC CCA GAT CAT GTT TGA GAC- 3'；下游5'- GCC AGG ATA GAG CCA CCA AT-3'。

TNF-α：上游5'-GTC AGC CGA TTT GCC ATT TCA- 3'；下游5'- ACA CGC CAG TCG CTT CAC AGA-3'。

Bcl-xL：上游5'-GTG CGT GGA AAG CGT AGA CA-3'；下游5'-CAG CCAAGG TGACCCATTAC-3'。

按照RT-PCR試劑盒說明進行TNF-a和Bcl-xL反應液體配置，按以下條件進行PCR反應。

TNF-α：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30個循環；72℃60 s，72℃5 min，4℃終止反應。

Bcl-xL：94℃2 min，94℃30 s，51℃30 s，30個循環；72℃60 s，72℃5 min，4℃終止反應。

β-actin：94℃2 min，94℃30 s，55℃30 s，30個循環；72℃60 s，72℃5 min。終止反應。

取PCR擴增產物5 μl，加入自行配制的6×上樣緩沖液1.0 μl，1.5%瓊脂糖凝膠上樣；在1×TBE緩沖液中，100 V恒壓電泳20 min；待產物充分電泳后，取出凝膠，Doc Gel 2000凝膠成像分析系統測定各條帶光密度值，以與β-actin的比值作為目的基因mRNA的相對表達量。

1.8統計學分析

所有實驗數據以(xˉ±s)表示，采用SPSS 17.0軟件進行統計學處理。多組間比較采用單因素方差分析(One-Way ANOVA)分析，兩兩比較采用q檢驗。顯著性水平α1=0.05，非常顯著性水平α2=0.01。

2　結果

2.1NF-κB P50蛋白

NC組可見NF-κB P50蛋白少量表達。各時間點I/ R組NF-κB P50蛋白表達較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組各時間點較I/R組NF-κB P50蛋白表達進一步增加(P<0.05)。FNL組各時間點NF-κB P50表達與I/R組相比無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.2TNF-α mRNA

NC組TNF-α mRNA少量表達。各時間點I/R組TNF-α mRNA表達較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組各時間點TNF-α mRNA表達較I/R組減少(P<0.05)。FNL組與I/R組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

2.3Bcl-xL mRNA

NC組Bcl-xL mRNA僅有極少量表達。各時間點I/R組Bcl-xL mRNA表達較NC組明顯增加(P<0.01)。FNS組表達較I/R組進一步增加(P<0.05)。各時間點FNL組與I/R組無顯著性差異(P>0.05)。見表1。

表1　各組大腦NF-кB P50蛋白，TNF-a mRNA和Bcl-xL mRNA表達

2.4梗死體積

NC組腦組織呈均勻紅色，無白色梗死區；I/R組、FNS組右側腦組織均可見大腦中動脈供血區呈白色梗死灶，左側腦組織呈均勻紅色。FNS組較I/R組顯著減少(P<0.001)，FNL組與I/R組無顯著性差異(P> 0.05)。見表2。

表2　各組大腦梗死體積比較(mm3)

3　討論

正常情況下，NF-κB與抑制分子IκBα非共價結合成三聚體復合物，以無活性的形式存在胞漿內，無法進入細胞核發揮作用。腦缺血及再灌注后，IκBα磷酸化、泛素化，最終降解，釋放游離NF-κB向細胞核內移位，與相應的κB位點結合[10-14]，迅速誘導靶基因轉錄。

NF-κB對神經細胞起保護還是損傷作用，目前還不十分清楚。傷害性刺激可引NF-κB活化，從而調控其下游基因的表達[15]。在大鼠腦缺血再灌注后30 min 或1 h時，NF-κB各亞基表達明顯升高；通過抑制NF-κB活化可減少TNF-α誘導的細胞死亡，從而提出抑制NF-κB活化可能對神經細胞有保護作用。

目前，NF-κB在中樞神經系統的保護作用也已被廣泛研究。NF-κB某亞基在中樞神經系統疾病中調控神經細胞存活，可能是由于激活Bcl-x、Bcl-2等表達[16]，并提出Bcl-x、Bcl-2的表達可能與NF-κB二聚體c-Rel/P50的活化有關。隨后研究發現，腦缺血后抑制c-Rel/P50的表達，可使Bcl-x的表達減少[17-20]。

Bcl-xL是Bcl-2家族的重要成員，是一類具有抗凋亡作用的蛋白，在維持細胞生存中起關鍵作用。Li等研究顯示，腦缺血后NF-κB的保護作用可能和NF-κB P50活化有關，敲除NF-κB P50后，神經細胞損傷較正常組明顯加重[21]。

本研究與既往研究均證實，正常腦組織有極少量NF-кB P50蛋白、Bcl-xL和TNF-α mRNA表達；腦缺血再灌注后可誘導NF-κB P50以及下游因子Bcl-xL和TNF-α mRA表達。本研究發現，腦缺血再灌注后予FNS治療可以顯著增加NF-κB P50表達，同時伴TNF-α表達減少。Bcl-xL啟動子中含有2個κB位點序列[22]。本研究顯示，FNS在增加NF-κB P50表達的同時，Bcl-xL的表達也相應增加，而FNL組NF-κB P50、Bcl-xL和TNF-α mRA的表達均無明顯改變。

小腦電刺激儀采用仿生物電流，將電極置于枕后乳突進行刺激，通過對小腦頂核的刺激作用，發揮神經保護作用。FNS治療可改善腦血管微循環，減輕炎癥因子的釋放，減輕神經損傷，減少缺血區神經元的壞死凋亡，減輕腦梗死體積，從而起到神經保護作用，促進神經功能恢復，部分改善缺血再灌注損害[23-25]，已廣泛應用于臨床。本研究表明，FNS可通過增加P50生成，而抑制下游炎癥因子TNF-α表達，增加抗調亡因子Bcl-xL的表達，減輕腦梗死體積，這可能是其神經保護機制之一。

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·基礎研究·

作者單位：1.成都市第二人民醫院神經內科，四川成都市610017；2.重慶醫科大學附屬第一醫院神經內科，重慶市400016；3.重慶市神經病學重點實驗室，重慶市400016。作者簡介：何蘭英(1979-)，女，漢族，四川成都市人，博士，副主任醫師，主要研究方向：缺血性腦血管病損傷及其保護機制。通訊作者：羅勇(1965-)，男，漢族，四川達州市人，研究員，博士生導師。E-mail: luoyong1998@163.com。

Effect of Electrical Stimulation to Cerebellar Fastigial Nucleus on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

HE Lan-ying1, LUO Yong2,3, WANG Jian1, DONG Wei-wei2,3
1. Department of Neurology, The Second People's Hospital of Chengdu City, Chengdu, Sichuan 610017; 2. Department of Neurology, The First Affiliated Hospital, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China; 3. Chongqing Key Laboratory of Neurology, Chongqing 400016, China

Abstract:Objective To investigate the effect of electrical stimulation to cerebellar fastigial nucleus on expression of nuclear factor-kappa B (NF-кB) P50, tumor necrosis factor-α(TNF-α) and Bcl-xL mRNA in rats brain after cerebral ischemia-reperfusion. Methods Sprague-Dawley rats were randomly divided into normal control group (NC group), cerebral ischemia-reperfusion group (I/R group), fastigial nucleus stimulation (FNS) group, and fastigial nucleus lesion (FNL) group. A focal cerebral ischemia-reperfusion model was established with middle cerebral artery occlusion (MCAO). 7 and 14 days after operation, the infarct volume was measured, and the protein of NF-кB P50 in rats brain was detected with Western blotting; the expression of TNF-α and Bcl-xL mRNA was detected with RT-PCR. Results Compared with I/R group, the expression of NF-кB P50 protein increased in FNS group (P<0.05), with the decrease of expression of TNF-α mRNA (P<0.01) and increase of Bcl-xL mRNA (P<0.05), while the infarct size decreased (P<0.01). There was no significant difference between FNL group and I/R group for all the measurements (P>0.05). Conclusion FNS could induce the expression of P50 protein and Bcl-xL mRNA, and inhibit the expression of TNF-α mRNA, and reduce infarct size, which may associated with the neuroprotection of central nervous system from injury.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; electrical stimulation; cerebellar fastigial nucleus; focal factor-kappa B; tumor necrosis factor-α; Bcl-xL; rats

(收稿日期：2015-03-28修回日期：2015-06-12)

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.006

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1012-04