電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬組織腦源性神經營養因子和神經營養素受體p75表達的影響

李曉潔，林如輝，陶靜，趙從快，俞坤強，李春燕，彭洪衛，陳立典

電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬組織腦源性神經營養因子和神經營養素受體p75表達的影響

李曉潔1，林如輝2，陶靜1，趙從快1，俞坤強1，李春燕1，彭洪衛1，陳立典3

[摘要]目的探討電針治療腦卒中后認知障礙的可能機制。方法45只Sprague-Dawley雄性大鼠隨機分為假手術組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。模型組、電針組用線栓法制備左側局灶性腦缺血1.5 h再灌注模型。電針組電針神庭、百會穴7 d。采用Morris水迷宮檢測大鼠學習記憶能力；Longa評分法觀察大鼠神經功能缺損情況；HE染色觀察大鼠海馬神經元形態結構變化；免疫印跡法檢測大鼠缺血側海馬組織中腦源性神經營養因子(BDNF)、神經營養素受體p75 (p75NTR)蛋白表達。結果與模型組相比，電針組逃避潛伏期縮短(P<0.05)，穿越平臺次數顯著增加(P<0.001)；神經功能缺損評分明顯減少(P<0.01)；缺血側海馬區細胞損傷較輕，BDNF表達明顯升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表達明顯降低(P<0.01)。結論電針能夠改善腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力，其機制可能與上調大鼠海馬組織中BDNF蛋白和下調p75NTR蛋白表達水平有關。

[關鍵詞]腦缺血再灌注；學習記憶；電針；腦源性神經營養因子；神經營養素受體p75；大鼠

[本文著錄格式]李曉潔，林如輝，陶靜，等.電針對腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力及海馬組織腦源性神經營養因子和神經營養素受體p75表達的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(9): 1020-1024.

CITED AS: Li XJ, Lin RH, Tao J, et al. Effects of electroacupuncture on learning and memory and expression of brain-derived neurotrophic factor and p75 neurotrophin receptor in rats with cerebral ischemia-reperfusion [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9):1020-1024.

認知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙[1-2]，不僅嚴重影響感覺、運動等其他功能康復，而且還會嚴重影響患者的日常生活能力和生活質量[3-4]。電針神庭、百會穴能在一定程度上改善腦卒中后認知功能障礙，但機制尚未完全闡明[5-7]。有研究指出，腦缺血發生時，腦源性神經營養因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)與神經營養素受體p75(p75 neurotrophin receptor, p75NTR)結合，激活c-Jun N-末端激酶(JNK)通路，從而誘導細胞凋亡[8]，影響認知功能。本研究觀察電針神庭、百會穴對局灶性腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力、海馬神經元形態結構及海馬組織中BDNF和p75NTR蛋白表達的影響，探討電針治療腦卒中后認知障礙的作用機制。

1　材料與方法

1.1實驗動物與分組

45只健康成年SPF級Sprague-Dawley大鼠，體質量(280±20) g，由福建中醫藥大學實驗動物中心提供，許可證號：SYXK(閩)2005-004。大鼠分籠飼養，每籠5只。適應性喂養1周后，用隨機數字表法將大鼠編號，分為假手術組(n=15)、模型組(n=15)和電針組(n=15)。

1.2主要實驗試劑及儀器

線栓：廣州佳靈生物技術有限公司。BDNF一抗：ABCAM公司。p75NTR一抗：Cell Signaling Technology公司。β-actin一抗、辣根過氧化物酶二抗：全式金公司。封閉液、一抗稀釋液、二抗稀釋液：碧云天公司。

華佗牌電針治療儀：蘇州醫療用品廠有限公司。Morris水迷宮：中國醫學科學院藥物研究所。Image-lab圖像分析系統：BIO-RAD公司。

1.3動物模型制備

在室溫22℃下，大鼠稱重，參考Longa等方法，行左側大腦中動脈阻塞(middle cerebral artery occlusion, MCAO)[9]。10%水合氯醛3 ml/kg腹腔注射麻醉，常規去毛消毒，正中切開頸部皮膚，暴露頸總動脈，向上分離出頸內動脈和頸外動脈主干；在頸內、外動脈分叉處結扎頸外動脈，在近心端結扎頸總動脈。用動脈夾夾閉頸內動脈，然后在頸總動脈結扎處遠端約3 mm處剪一小口，將備好的線栓從切口導入。撤去頸內動脈血管夾，經頸內動脈緩慢推入線栓至大腦前動脈近端，約插入18～22 mm。固定線栓，縫合傷口。1.5 h后回抽線栓至頸總動脈分叉處。試驗過程和動物蘇醒期間注意保暖。

假手術組只分離動脈，不結扎、插線。

動物蘇醒后觀察其體態及行為，不合格的動物剔除。

1.4干預方法

電針組參考《實驗針灸學》[10]取大鼠神庭和百會穴，應用華佗牌SDZ-V電針儀，針具采用無磁的金合銀針，電流1～3 mA，以針體輕輕抖動為度，疏密波，頻率2/10 Hz。造模后第2天開始，每次30 min，每天1次，共7 d。

假手術組、模型組置于普通籠中飼養，只給予同等條件抓取，不給予任何治療。

1.5Morris水迷宮

Morris水迷宮為直徑200 cm、高50 cm的圓形水池，水深30 cm，水溫(25±2)℃；圓形逃逸平臺直徑6 cm，低于水面2 cm，置于某一象限中央。室溫22℃，屋頂和四壁表面光滑整潔，照明設備四周對稱。各組造模后第3天開始檢測。主要包括定位航行試驗和空間探索試驗。

定位航行試驗歷時4 d。大鼠自由游泳2 min以適應環境和人的抓握等相關操作。分別從水池4個象限將大鼠面向池壁放入水中，測其在90 s內找到平臺所需的時間(逃避潛伏期)，由計算機記錄各種參數。如果大鼠90 s內未找到平臺，將其牽引到平臺，停留10 s，潛伏期記為90 s。

在造模后第7天撤除平臺，記錄大鼠在90 s內穿過原平臺所在位置的次數。

1.6神經功能缺損評分

采用Longa評分法[9]：0分，無神經功能缺損；1分，提尾時右前肢內收，不能完全伸展；2分，自發行走時向右側轉圈；3分，行走時身體向右側傾倒；4分，不能自發行走，有意識喪失。得分1～3分者為造模成功；不合格的動物剔除。于造模后7 d再次評分。

1.7取材及檢測

1.7.1HE染色

麻醉下開胸，生理鹽水200 ml經左心室快速沖洗，4%多聚甲醛(pH=7.4) 200 ml灌流固定。取腦后置入4%多聚甲醛內4℃固定24～48 h。定位海馬區，常規脫水，石蠟包埋，冠狀切片，片厚約5 μm。二甲苯脫蠟、梯度酒精脫水，蘇木精和伊紅染色，光鏡下觀察組織病理學變化。

1.7.2蛋白免疫印跡法

取缺血側海馬組織置液氮罐中速凍，-80℃冰箱保存。取大鼠海馬組織100 mg，加入裂解液1 ml和絲氨酸蛋白酶抑制劑PMSF 10 μl，研磨均勻后靜置30 min，取上清；4℃14 000 r/min離心5 min，吸取上清，BCA測定蛋白濃度。待樣品蛋白變性后，10% SDS-PAGE電泳，轉移到PVDF膜，封閉2 h后，分別加BDNF一抗(1∶2000)、p75NTR一抗(1∶750)、β-actin一抗(1∶5000)孵育，4℃過夜；用辣根過氧化物酶標記的二抗(1∶5000)室溫孵育1 h。將PVDF膜放于圖像掃描儀上，避光配置顯色液并覆蓋PVDF膜1 min，Image-lab圖像分析系統分析。以β-actin為內參，計算目的蛋白相對灰度。

1.8統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行分析。水迷宮數據采用重復測量方差分析。神經功能缺損評分不滿足正態性，采用Mann-Whitney U檢驗。免疫印跡法數據滿足正態性，采用ANOVA分析。數據均以(xˉ±s)表示，顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1Morris水迷宮

模型組造模后逃避潛伏期時間比假手術組顯著延長(P<0.001)，電針組逃避潛伏期時間比模型組縮短(P<0.05)。見表1。與假手術組相比，模型組穿越平臺次數顯著減少(P<0.001)；與模型組相比，電針組穿越平臺次數顯著增加(P<0.001)。見表2。

表1　各組定位航行實驗逃避潛伏期比較(s)

表2　各組大鼠空間探索實驗穿越平臺次數比較

2.2神經功能缺損評分

假手術組無神經功能缺損癥狀。造模后第1天模型組及電針組均出現神經功能缺損，兩組間神經功能缺損評分無顯著性差異(P>0.05)；造模后第7天，電針組神經功能缺損評分明顯低于模型組(P<0.01)。見表3。

表3　各組神經功能缺損評分比較

2.3HE染色

模型組海馬CA1、CA3區神經細胞稀少、排列疏松；殘存神經元固縮破裂，存在空泡樣變。電針組海馬CA1、CA3區損傷較模型組輕，結構較完整。假手術組未見病理改變(圖1)。

2.4免疫印跡法

與假手術組相比，模型組缺血側海馬組織中BDNF、p75NTR蛋白表達水平顯著升高(P<0.001)；與模型組相比，電針組大鼠缺血側海馬組織中BDNF蛋白表達水平明顯升高(P<0.01)，p75NTR蛋白表達水平明顯降低(P<0.01)。見表4。

表4　各組BDNF、p75NTR蛋白表達比較

圖1　各組大鼠海馬CA1、CA3區神經元(HE染色，400×)

3　討論

認知功能障礙是腦卒中后常見的功能障礙。有研究指出，由于不同的卒中亞型和診斷標準，腦卒中患者17%～92%在腦卒中后3個月存在輕度認知障礙[11]。

臨床研究表明，電針在一定程度上能改善腦卒中后認知障礙[12-14]。神庭為督脈、足陽明、太陽之會，百會為督脈、足太陽之會。神庭、百會穴皆屬于督脈，兩穴合用常起到開竅醒神的作用。

本研究顯示，電針能改善腦缺血再灌注大鼠神經行為功能；HE染色觀察缺血側海馬組織中神經細胞的溶解減少。這與前期研究結果[5-7,15]相一致，表明電針可以改善腦卒中后認知功能障礙。

BDNF是神經營養因子家族重要成員之一[16-17]，在腦中分布廣泛，位于皮質、海馬、基底節等區域。BDNF是由Barde等于1982年首次從豬腦中分離純化出的具有促進神經生長活性的一種蛋白質[18-19]。有研究表明，BDNF在腦缺血損傷中，對維持神經元功能及抑制凋亡起著重要作用[20-21]。

p75NTR是腫瘤壞死因子受體家族中的一員[22-23]，能與神經生長因子、BDNF等諸多神經營養因子以低親和力結合[24-25]。有研究表明，腦缺血損傷時，BDNF 與p75NTR結合，激活JNK通路，引發級聯反應，誘導神經元凋亡[8]。本研究表明，電針可以明顯下調腦缺血再灌注大鼠海馬組織中p75NTR蛋白水平，從而減少BDNF與p75NTR的結合，進而可能阻斷下游JNK通路的激活，從而抑制細胞凋亡。這可能是電針改善腦缺血再灌注大鼠學習記憶能力的機制之一。

綜上所述，電針能改善局灶性腦缺血再灌注大鼠的學習記憶能力，其作用機制可能與下調大鼠海馬組織中p75NTR蛋白水平，從而減少BDNF與其受體p75NTR的結合有關。然而，由于腦卒中后認知功能障礙機制的復雜特性，以及電針作用的多靶點特性，其確切機制還需要進一步深入研究。

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·基礎研究·

作者單位：1.福建中醫藥大學康復醫學院，福建福州市350122；2.福建中醫藥大學中西醫結合研究院，福建福州市350122；3.福建中醫藥大學，福建福州市350122。作者簡介：李曉潔(1989-)，女，漢族，江蘇無錫市人，碩士研究生，主要研究方向：神經康復與認知科學研究。通訊作者：陳立典(1963-)，男，漢族，福建政和縣人，博士，教授，主要研究方向：神經康復與認知科學研究。E-mail: cld@fjtcm.edu.cn。

Effects of Electroacupuncture on Learning and Memory and Expression of Brain-derived Neurotrophic Factor and p75 Neurotrophin Receptor in Rats with Cerebral Ischemia-reperfusion

LI Xiao-jie1, LIN Ru-hui2, TAO Jing1, ZHAO Cong-kuai1, YU Kun-qiang1, LI Chun-yan1, PENG Hong-wei1, CHEN Li-dian3
1. Rehabilitation Medicine College, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 2. Academy of Integrative Medicine, Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China; 3. Fujian University of Traditional Chinese Medicine, Fuzhou, Fujian 350122, China

Abstract:Objective To observe the effects of electroacupuncture on learning and memory, and discuss the therapeutic mechanism. Methods 45 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=15), model group (n=15) and electroacupuncture group (n= 15). The latter 2 groups were modeled with middle cerebral artery occlusion for 1.5 h and reperfusion. The rats of electroacupuncture group received electroacupuncture at Shenting (DU24) and Baihui (DU20) for 7 days. Learning and memory ability was tested with Morris water maze. Neurologic impairment was assessed with Longa's score. Their hippocampus were observed under HE staining and the level of brain-derived neurotrophic factor (BDNF) and p75 neurotrophin receptor (p75NTR) protein were determined with Western blotting. Results Compared with the model group, the latency of water maze decreased and the times crossing the platform increased in electroacupuncture group (P<0.05), while the Longa's score significantly reduced (P<0.05), and the lesion of nerve cells were alleviated, with the decrease of p75NTR and increase of BDNF in the ischemic hippocampus (P<0.01). Conclusion Electroacupuncture can improve the learning and memory of cerebral ischemia-reperfusion rats, which may relate with up-regulating BDNF and down-regulating p75NTR in hippocampus.

Key words:cerebral ischemia-reperfusion; learning and memory; electroacupuncture; brain-derived neurotrophic factor; p75 neurotrophin receptor; rats

(收稿日期：2015-07-23修回日期：2015-08-18)

基金項目：福建省康復技術協同創新中心資助項目(No.X2012004－協同)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.008

[中圖分類號]R743.3

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1020-05