血管性癡呆大鼠海馬齒狀回神經前體細胞增殖的動態變化及養血清腦顆粒的影響

李晶，劉穎，劉斌，羅永偉，范穎，馬原源，毛文靜，李世英

血管性癡呆大鼠海馬齒狀回神經前體細胞增殖的動態變化及養血清腦顆粒的影響

李晶，劉穎，劉斌，羅永偉，范穎，馬原源，毛文靜，李世英

[摘要]目的觀察血管性癡呆(VD)大鼠海馬齒狀回(DG)神經前體細胞(NPCs)增殖的動態變化及養血清腦顆粒的影響。方法72只Sprague-Dawley大鼠隨機分為假手術組(n=24)、VD模型組(模型組, n=24)和養血清腦顆粒治療組(治療組, n=24)，采用改良的Pulsinelli四血管阻斷法制作VD大鼠模型。分別在造模術后1、2、4和8周采用Western blotting法檢測Nestin的表達水平，用免疫熒光法觀察海馬齒狀回區5-溴脫氧尿嘧啶(BrdU)和BrdU/Nestin的表達。結果模型組和治療組各時間點大鼠Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達持續增多，4周時達高峰。與假手術組比較，模型組各時間點Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達明顯增多(P< 0.01)；與模型組比較，治療組各時間點Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達明顯增多(P<0.01)。結論養血清腦顆粒可促進VD大鼠海馬齒狀回區NPCs增殖。

[關鍵詞]血管性癡呆；神經前體細胞；增殖；齒狀回；海馬；養血清腦顆粒

[本文著錄格式]李晶，劉穎，劉斌，等.血管性癡呆大鼠海馬齒狀回神經前體細胞增殖的動態變化及養血清腦顆粒的影響[J].中國康復理論與實踐, 2015, 21(9): 1025-1030.

CITED AS: Li J, Liu Y, Liu B, et al. Proliferation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus and effect of Yangxue Qingnao Granule in vascular dementia rats [J]. Zhongguo Kangfu Lilun Yu Shijian, 2015, 21(9): 1025-1030.

血管性癡呆(vascular dementia, VD)是發生在腦血管疾病基礎上的以記憶、認知功能缺損為主的獲得性智力持續性損害[1]。目前，在VD的發病機制和診斷方面取得了一定進展，但在治療方面尚無重大突破[2-4]。養血清腦顆粒是根據中醫藥理論，以中醫傳統名方四物湯為基礎改良而成的中藥復方制劑，具有滋陰養血、平肝潛陽、活血通絡的功效[5]，臨床上應用養血清腦顆粒能明顯改善VD患者認知功能和日常生活能力[6]，但其具體作用機制尚不明確。巢蛋白(Nestin)是哺乳動物神經系統先祖細胞中的一種主要細胞骨架蛋白，在成年大鼠及成人腦內廣泛存在，為神經前體細胞(neural precursor cells, NPCs)的標記物[7-9]。本研究通過檢測大鼠海馬齒狀回(dentate gyrus, DG)Nestin、5-溴脫氧尿嘧啶(5-bromodeoxyuridine, BrdU)的表達，觀察VD大鼠海馬齒狀回NPCs增殖的動態變化及養血清腦顆粒對其表達的影響，探討養血清腦顆粒治療VD的可能作用機理。

1　材料與方法

1.1實驗動物與器材

健康雄性Sprague-Dawley(SD)大鼠72只，體質量250～280 g，3月齡，由北京華阜康生物科技股份有限公司供給，合格證號SCXK(京)2013-0013。在華北理工大學屏障環境動物實驗室自由進食喂養，室溫(23± 2)℃，自然光照，實驗前適應喂養2周。

養血清腦顆粒，國藥準字Z10960082，批號130366：天津天士力制藥股份有限公司。山羊血清封閉液、多聚賴氨酸溶液：北京博奧森生物技術公司。兔抗大鼠Nestin抗體：Eter Life公司。小鼠抗BrdU抗體：BD公司。DyLigh?488標記羊抗鼠IgG和DyLigh ?594標記羊抗兔IgG：KPL公司。

低溫離心機：SIGMA公司。電凝儀：張家港航天醫療電器有限公司。切片機：上海億欣生物科技有限公司。Morris水迷宮：淮北正華生物儀器設備有限公司。

1.2方法

1.2.1動物分組

將大鼠編號，用隨機數生成器隨機抽取不同數字，將大鼠分為假手術組、VD模型組(模型組)和養血清腦顆粒治療組(治療組)，在模型制備成功后又隨機分為造模術后1周、2周、4周和8周4個亞組，每個亞組6只。

1.2.2模型制備

采用改良的Pulsinelli四血管阻斷(4-VO)法制作VD大鼠模型[10]。術前禁食12 h，10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，背側行頸正中切口，暴露雙側第一頸椎橫突小孔。將直徑0.5 mm的電凝針插入雙側翼小孔燒灼雙側椎動脈。大鼠仰臥位固定，行腹側頸正中切口，分離雙側頸總動脈，以4號絲線穿線。24 h后用微動脈夾夾閉雙側頸總動脈5 min，共夾閉3次，每次間隔1 h。縫合切口。繼續常規飼養觀察。假手術組操作步驟同上，但不燒灼和夾閉血管。術后大鼠予慶大霉素1×104U/kg腹腔注射，連續3 d。

1.2.3給藥方法

造模成功后灌胃給藥，每日1次。假手術組、模型組予生理鹽水10 ml/kg；治療組將養血清腦顆粒用蒸餾水配成0.32 g/ml混懸液，10 ml/kg灌胃[11]。連續給藥1、2、4、8周。

1.3學習記憶能力測定

大鼠分別于灌胃給藥后1、2、4、8周行Morris水迷宮試驗，觀察穿越平臺次數。

1.4BrdU標記

大鼠處死前1 d腹腔注射%生理鹽水溶液50 mg/ kg (10 g/L)，注射3次，間隔4 h；取腦前2 h注射第4次。

1.5Western blotting檢測

Morris水迷宮試驗后，大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，斷頭后于冰上開顱取腦，用冷PBS漂洗殘余血，立即分離出新鮮海馬。海馬組織置于15 ml離心管中，組織勻漿機12000 r/min勻漿15 s，加入4℃預冷組織裂解液，振蕩混勻，4℃作用30 min；細胞懸液4℃12 000 r/min離心10 min，留取上清液4℃保存。

蛋白定量后分裝，用4℃PBS調蛋白濃度750 μg/ml，加入等體積上樣緩沖液，沸水煮至少5 min。等量蛋白樣品(每個泳道50μg)經10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酸銨凝膠電泳(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis, SDS- PAGE)電泳分離后，以濕轉法電轉移至聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride, PVDF)膜上。轉移后的PVDF膜放入封閉液中封閉，加入兔抗大鼠Nestin一抗(1∶1000) 4℃孵育過夜。PBS洗膜，加入二抗(1∶2000)，37℃反應1 h；洗膜，ECL顯色，膠片曝光顯影，結果用Image J軟件分析。以Nestin蛋白與β-actin蛋白的相對光密度(OD)進行半定量分析。

1.6免疫熒光檢測

Morris水迷宮試驗后，大鼠10%水合氯醛350 mg/kg腹腔注射麻醉，暴露心臟，左心室快速灌注鹽水100 ml，持續灌注4%多聚甲醛-PBS 100 ml，斷頭取腦，4%多聚甲醛-PBS固定過夜。冠狀面切斷包含海馬的腦組織(視交叉后)，石蠟包埋，5 μm連續切片。

免疫熒光檢測方法按照試劑盒操作說明書進行。石蠟切片脫蠟，水化組織切片，加入正常羊血清封閉。分別加入BrdU一抗(1∶100)和Nestin一抗(1∶200)的混合液，4℃過夜。次日加入相應二抗混合液(1∶200)，室溫避光孵育1 h，PBS洗10 min，共3次。以0.01 mol/L PBS代替一抗作為陰性對照。OLYMPUS BX53顯微鏡下觀察并拍照。應用圖像分析系統計數大鼠海馬齒狀回區BrdU、BrdU/Nestin陽性細胞數。每只大鼠隨機選取海馬齒狀回區各3張切片，隨機取6個非重疊視野，取平均值。

熒光顯微鏡下，細胞核出現綠色顆粒者為BrdU陽性細胞，藍光激發時呈綠色的為BrdU陽性細胞，黃光激發時呈紅色的為Nestin陽性細胞。BrdU/Nestin融合后胞膜呈紅色，胞核呈綠色。

1.7統計學分析

用SPSS 17.0統計軟件進行數據分析。所得數據以(xˉ±s)表示。多組數據間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。顯著性水平α=0.05。

2　結果

2.1一般情況

造模后4周左右，大鼠出現VD行為學改變，其中5只由于病情過重淘汰，另有3只死亡。均給予相應補充。

2.2學習記憶能力

與假手術組比較，模型組大鼠穿越平臺次數明顯減少(P<0.01)；與模型組比較，治療組大鼠穿越平臺次數明顯增加(P<0.01)。見表1。

表1　各組大鼠穿越平臺次數比較

2.3Western blotting

假手術組各時間點可見少量Nestin表達。模型組各時間點Nestin表達增多，4周時達高峰。與假手術組相比，模型組各時間點Nestin表達明顯增多(P< 0.01)。治療組各時間點Nestin表達較模型組明顯增加(P<0.01)。見表2。

表2　各組大鼠海馬齒狀回Nestin比較(OD)

2.4免疫熒光

假手術組各時間點可見少量BrdU陽性細胞，呈散在分布。模型組各時間點BrdU陽性細胞表達增多，沿著海馬區齒狀回的顆粒下區呈線狀非連續排列，局部可見陽性細胞堆積；1周時即有多量表達，2周時大量表達，4周時達高峰，8周時開始下降但仍較高。與假手術組相比，模型組各時間點BrdU陽性細胞數明顯增多(P<0.01)。治療組各時間點BrdU陽性細胞數較模型組明顯增多(P<0.01)。見表3和圖1。

選擇增殖反應最明顯的第4周作為觀察點。假手術組大鼠海馬齒狀回可見少量BrdU/Nestin陽性細胞，平均(5.00±1.79)個/高倍視野(HD)。模型組和治療組BrdU/Nestin陽性細胞數明顯增多，主要分布在顆粒細胞下層(圖2)。模型組BrdU/Nestin陽性細胞數(23.50±2.35)個/HD，較假手術組明顯增多(P<0.01)；治療組BrdU/Nestin陽性細胞數(33.50±1.87)個/HD，較模型組明顯增加(P<0.01)。

表3　各組大鼠海馬齒狀回BrdU陽性細胞數比較(/HD)

圖1　各組大鼠海馬齒狀回BrdU免疫熒光染色(400×)

圖2　各組給藥后4周大鼠海馬齒狀回BrdU/Nestin免疫熒光染色(400×)

3　討論

VD的基礎疾病是腦血管疾病，慢性腦缺血是VD發生的主要病因之一[12]。本研究采用的4-VO法，是目前國內外公認的理想的VD動物模型，已被廣泛用于VD治療的研究。Morris水迷宮測試表明，模型組大鼠跨越平臺的次數明顯減少，提示造模成功；予養血清腦顆粒治療，大鼠穿越平臺次數增加，表明養血清腦顆粒能改善VD大鼠學習記憶能力。

在成年哺乳動物及人類中樞神經系統中，特別是在海馬齒狀回顆粒下層存在著具有增殖分化潛能的NPCs[13]，可分化發育成神經元和神經膠質細胞，以補充和替代神經細胞的損傷和缺失，發揮內源性修復作用[14]。

Nestin是構成細胞骨架的一種中間絲蛋白，屬于第Ⅳ類中間絲蛋白，為Hockfield和Mckay在大鼠胚胎脊髓神經管NPCs表達的蛋白中發現一種能被anti-nestin抗體特異性識別的蛋白[15]。Nestin分布在細胞質內，在神經胚胎形成階段特異性表達于神經內皮干細胞，并在NPCs進行神經元終末分化后開始下降，并隨細胞成熟而停止表達。體外培養Nestin陽性細胞可分化出神經元與膠質細胞的前體細胞，常被用來作為NPCs的標記物[8]。

BrdU是一種胸腺嘧啶脫氧核苷類似物，在細胞增殖周期的S期嵌入細胞核DNA中，可隨細胞的進一步分裂、分化，進入分裂后的子細胞中，直至分化成熟依然存在，并永久標記在細胞內[16]。BrdU陽性細胞數基本可代表腦內NPCs的發生水平，BrdU陽性細胞被看作是具有增殖活性的細胞[17]。

本研究顯示，模型組各時間點大鼠海馬齒狀回區Nestin、BrdU和BrdU/Nestin表達均增多，說明VD大鼠海馬齒狀回區NPCs呈激活狀態，被誘導增殖分化的神經細胞大量表達Nestin，與文獻報道一致[18-19]。

NPCs具有分化成神經元和神經膠質細胞的潛能，參與神經修復過程，可能在治療各種中樞神經系統疾病，包括神經變性疾病、脫髓鞘病、腦血管病方面有益[20-21]。研究發現，增加大鼠海馬區Nestin陽性細胞對細胞具有保護作用，能促使缺血再灌注后功能恢復[22]。

養血清腦顆粒主要由川芎、當歸、白芍、鉤藤、熟地黃、雞血藤、決明子、夏枯草、細辛、延胡索、珍珠母組成，在改善軟腦膜微循環、增加腦血管量、減輕腦損傷等方面具有顯著效果[23]。養血清腦顆粒具有養血活血、平肝潛陽的作用，標本兼治，符合中醫治療VD的要求。作為現代中藥復方制劑，養血清腦顆粒具有多靶點、多環節、整體性調節機體的特點。文獻報道，養血清腦顆粒能抑制神經細胞凋亡，保護神經元缺血性損害[24-25]。本研究顯示，養血清腦顆粒治療后，大鼠海馬齒狀回區Nestin、BrdU表達增加，提示促進VD大鼠海馬齒狀回區內源性NPCs增殖分化，且隨著用藥時間的延長，作用更明顯。這可能是養血清腦顆粒發揮VD治療作用的機制之一。

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·綜述·

Proliferation of Neural Precursor Cells in Dentate Gyrus of Hippocampus and Effect of Yangxue Qingnao Granule in Vascular Dementia Rats

LI Jing, LIU Ying, LIU Bin, LUO Yong-wei, FAN Ying, MA Yuan-yuan, MAO Wen-jing, LI Shi-ying
First Department of Neurology, Hospital Affiliated to North China University of Science and Technology, Tangshan, Hebei 063000, China

Abstract:Objective To observe dynamic variation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus and effect of Yangxue Qingnao Granule on it in vascular dementia rats. Methods 72 Sprague-Dawley rats were randomly divided into sham group (n=24), vascular dementia group (model group, n=24) and Yangxue Qingnao Granule group (treatment group, n=24). The vascular dementia model was established with modified Pulsineli's four-vessel occlusion. The expression of Nestin was detected with Western blotting, the expression of 5-bromodeoxyuridine (BrdU) and BrdU/Nestin were detected with immunofluorescence in dentate gyrus of hippocampus 1, 2, 4 and 8 weeks after modeling. Results The expression of Nestin, BrdU and BrdU/Nestin increased in the model and treatment groups with time, peaked at 4 weeks after modeling, and it was more than that of the sham group on all the time points (P<0.01). However, it was more in the treatment group than in the model group on all the time points (P<0.01). Conclusion Yangxue Qingnao Granule promotes the proliferation of neural precursor cells in dentate gyrus of hippocampus in vascular dementia rats.

Key words:vascular dementia; neural precursor cells; proliferation; dentate gyrus; hippocampus; Yangxue Qingnao Granule

(收稿日期：2015-05-03修回日期：2015-07-22)

作者簡介：作者單位：華北理工大學附屬醫院神經內一科，河北唐山市063000。李晶(1990-)，女，漢族，河北邢臺市人，碩士研究生，主要研究方向：腦血管病及認知障礙。通訊作者：劉斌，男，碩士，主任醫師，教授，研究生導師。E-mail: liubintsh@126.com。

基金項目：1.河北省高等學校科學技術研究重點項目(No.ZH2012046)；2.河北省級重大醫學科研課題(No.zd2013087)。

DOI:10.3969/j.issn.1006-9771.2015.09.009

[中圖分類號]R743

[文獻標識碼]A

[文章編號]1006-9771(2015)09-1025-06