地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)的影響

張 麗，白茹芹南京市胸科醫(yī)院藥劑科，南京 009；江蘇省中醫(yī)院藥劑科，南京 009

地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)的影響

張 麗1，白茹芹2*
1南京市胸科醫(yī)院藥劑科，南京 210029；2江蘇省中醫(yī)院藥劑科，南京 210029

目的：研究地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)的影響。方法：用卵蛋白制備過(guò)敏性哮喘豚鼠模型，觀察地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠肺組織病理及IL-4R mRNA表達(dá)水平的影響。結(jié)果：地氯雷他定能顯著改善過(guò)敏性哮喘豚鼠肺組織病理變化，明顯降低肺組織IL-4R mRNA表達(dá)水平。結(jié)論：降低肺組織IL-4R mRNA的表達(dá)可能是地氯雷他定防治哮喘的基因機(jī)制。

地氯雷他定；過(guò)敏性哮喘；豚鼠；病理；IL-4受體

哮喘是由多種細(xì)胞（如嗜酸性粒細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞和氣道上皮細(xì)胞等）和細(xì)胞組分參與的氣道慢性炎癥性疾病[1]。地氯雷他定是氯雷他定在體內(nèi)的活性代謝產(chǎn)物，屬于第三代抗組胺藥，研究證實(shí)地氯雷他定能抑制肥大細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和嗜堿性粒細(xì)胞釋放細(xì)胞因子[2]。本課題組前期研究表明，地氯雷他定能顯著延長(zhǎng)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型哮喘潛伏期，明顯降低哮喘模型豚鼠肺泡灌洗液IL-4和IL-13水平，起到延緩哮喘發(fā)作的作用[3]。本研究以地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織病理及IL-4受體（IL-4R）表達(dá)的影響，從基因水平探討地氯雷他定防治哮喘的機(jī)制。

1 材 料

1.1 藥品與試劑

地氯雷他定（批號(hào)：14STBA001，上海先靈葆雅制藥有限公司）；卵蛋白（武漢生命技術(shù)有限公司進(jìn)口分裝，Sigma）；地塞米松片（天津天藥藥業(yè)股份有限公司）；RNA抽提試劑TRIzol、實(shí)時(shí)定量PCR擴(kuò)增預(yù)混溶液SYBR Green mix（日本Takara公司）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒（美國(guó)ABI公司）；引物合成（上海生工公司）。

1.2 儀器

S-888F型超聲霧化器（中外合資南京道芬電子有限分司）；Nanodrop 2000核酸定量?jī)x（美國(guó)Thermofish公司）；StepOnePlusTM實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（美國(guó)ABI公司）。

1.3 動(dòng)物

豚鼠，60只，體重160～180 g，雌雄各半，由南京江寧青龍山動(dòng)物繁殖場(chǎng)提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證：SCXK（蘇）2012-0013。

2 方 法

2.1 過(guò)敏性哮喘豚鼠模型的制備

取豚鼠52只，按文獻(xiàn)方法造模[4]。每只豚鼠腹腔注射10%卵蛋白生理鹽水溶液1 mL，2周后進(jìn)行引喘，取20 mL的1%卵蛋白生理鹽水注入超聲霧化器，將豚鼠放入霧化箱內(nèi)，開(kāi)動(dòng)霧化器，當(dāng)豚鼠出現(xiàn)喘促、咳嗽等呼吸道痙攣梗阻癥狀時(shí)，表示過(guò)敏性哮喘豚鼠造模成功。取出豚鼠，記錄哮喘潛伏期，即霧化開(kāi)始至豚鼠出現(xiàn)喘促、咳嗽的時(shí)間，若潛伏期超過(guò)4 min則示造模不成功。

2.2 分組給藥

取造模成功的豚鼠32只，隨機(jī)分為4組，每組8只，分別為（1）模型對(duì)照組：生理鹽水5 mL·kg-1；（2）地氯雷他定Ⅰ組：0.1 mg·kg-1；（3）地氯雷他定Ⅱ組：0.3 mg·kg-1；（3）地塞米松組：0.1 mg·kg-1。每組豚鼠灌胃給藥，每日1次，連續(xù)5 d。末次給藥后1 h，按“2.1”法對(duì)豚鼠進(jìn)行引喘。另取8只正常豚鼠做空白對(duì)照。

2.3 肺組織病理切片

完成上述實(shí)驗(yàn)[3]左肺灌洗后，取豚鼠右肺，切取部分肺組織，用4%多聚甲醛溶液固定24 h，石蠟包埋、切片，HE染色，光鏡下觀察肺組織病理狀況。

2.4 組織mRNA提取、反轉(zhuǎn)錄及qRT-PCR

另取部分肺組織置研缽中，液氮預(yù)冷，待組織冷凍后使用研磨器充分研磨，TRIzol法提取組織總RNA，以Nanodrop微量分光光度計(jì)檢測(cè)RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄試劑盒將1 μg RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，然后在StepOnePlusTM實(shí)時(shí)定量PCR儀上進(jìn)行檢測(cè)。反應(yīng)體系包含10 μL SYBR Green mix，3 μL cDNA模板，0.8 μL上下游引物，5.4 μL去離子水。IL-4R上游引物為5'-CTTACCGCAGCTTCAGCGAC-3'，下游引物為5'-CACAGTGGTTGGCTCAGAGA-3'。GAPDH為內(nèi)參基因，上游引物為5'-CATTGTATCCGTTGTGGATCTGACATGC-3'，下游引物為5'-CCCTGTTGCTGTAGCCATATTTGT-3'。擴(kuò)增條件為：95℃預(yù)變性5 min，接著94℃變性30 s，57℃退火30 s，72°C延伸1 min，擴(kuò)增35個(gè)循環(huán)。采用ΔΔCt法分析數(shù)據(jù)，結(jié)果用2ΔΔCt表示。

2.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

3 結(jié) 果

3.1 各組豚鼠肺組織病理形態(tài)學(xué)觀察

空白對(duì)照組豚鼠肺組織支氣管和肺泡結(jié)構(gòu)清晰，基本無(wú)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；模型對(duì)照組豚鼠支氣管壁、肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)可見(jiàn)以嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞為主的大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)；地氯雷他定Ⅰ組豚鼠炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯少于模型對(duì)照組；地氯雷他定Ⅱ組和地塞米松組豚鼠支氣管壁、肺間質(zhì)及肺泡腔內(nèi)偶見(jiàn)嗜酸性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，并可見(jiàn)少量淋巴細(xì)胞浸潤(rùn)。HE染色觀察豚鼠肺組織病理學(xué)改變見(jiàn)圖1。

圖1 HE染色觀察豚鼠肺組織病理學(xué)改變（×200）

3.2 地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)的影響

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，模型對(duì)照組與正常對(duì)照組比較豚鼠肺組織IL-4R mRNA表達(dá)水平顯著升高 （P＜0.01），而給予藥物后肺組織IL-4R mRNA表達(dá)水平與模型對(duì)照組比較顯著降低（P＜0.05，P＜0.01），用藥組組間比較無(wú)差異（P＞0.05）。結(jié)果見(jiàn)圖2。

4 討 論

圖2 地氯雷他定對(duì)過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)的影響（±s，n=8）

Th2細(xì)胞分泌的多種細(xì)胞因子，如白介素4（IL-4）、IL-5和IL-13等，在哮喘發(fā)病過(guò)程中具有重要作用[5]。IL-4能使嗜酸性粒細(xì)胞數(shù)目增多，使炎性反應(yīng)、氣道高反應(yīng)性增強(qiáng)[6]。IL-13可刺激B細(xì)胞的增殖和IgE的合成，后者通過(guò)與肥大細(xì)胞、嗜堿粒細(xì)胞的作用而誘發(fā)哮喘的急性發(fā)作[7]。IL-4和IL-13的生物活性都是通過(guò)與細(xì)胞表面相應(yīng)受體IL-4R或IL-13R結(jié)合，繼而激活細(xì)胞內(nèi)多種非受體型蛋白質(zhì)酪氨酸激酶而完成的[8]。IL-4R的α亞基為IL-13受體的組件之一，因此IL-4和IL-13均可與IL-4R結(jié)合發(fā)揮生物學(xué)效應(yīng)[9]。本研究顯示，過(guò)敏性哮喘豚鼠模型肺組織IL-4R mRNA表達(dá)明顯增強(qiáng)，這與以往文獻(xiàn)研究結(jié)果一致[10]。目前，口服抗過(guò)敏藥物已成為治療輕中度過(guò)敏性哮喘的推薦用藥[11]。本實(shí)驗(yàn)中，給予地氯雷他定后，過(guò)敏性哮喘豚鼠模型的肺組織病理變化明顯改善，肺組織IL-4R mRNA表達(dá)較模型組明顯降低，這可能是地氯雷他定防治哮喘的基因機(jī)制。

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Effects of Desloratadine on the Expression of IL-4 Receptor mRNA in Lung Tissues of Allergic Asthma Guinea Pig

ZHANG Li1,BAI Ru-qin2*
1Depatment of Pharmacy,Nanjing Chest Hospital,Nanjing 210029;2DepartmentofPharmacy,Jiangsu Province Hospital of TCM,Nanjing 210009

Objective:To study the effects of desloratadine on the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues of allergic asthma guinea pig.Methods:The allergic asthma model of guinea pig was induced by ovalbumin.Then the effects of desloratadine were observed on the pathological changes and the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Results:Desloratadine could improve the pathological changes and decrease the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues.Conclusion:Decreasing the expression of IL-4 receptor mRNA in lung tissues may be the mechanism of desloratadine in treating asthma.

Desloratadine;Allergic asthma;Guinea pig;Pathology;IL-4 receptor

R965.1

A

1673-7806（2015）06-552-03

張麗，女，主管藥師 E-mail:njchzli@tom.com

*通訊作者白茹芹，女，副主任藥師 E-mail:1537084738@qq.com

2015-05-27

2015-07-20