全血及血清中羥氯喹HPLC測(cè)定方法的建立及其應(yīng)用

羅雪梅，司慧敏，姚 瑤，葛衛(wèi)紅*

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院1藥學(xué)部，2風(fēng)濕免疫科，南京 210008

全血及血清中羥氯喹HPLC測(cè)定方法的建立及其應(yīng)用

羅雪梅1，司慧敏2，姚 瑤1，葛衛(wèi)紅1*

南京大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬鼓樓醫(yī)院1藥學(xué)部，2風(fēng)濕免疫科，南京 210008

目的：建立高效液相色譜法測(cè)定人全血及血清中羥氯喹濃度。方法：200 μL人全血（血清）樣品經(jīng)400 μL的10%甲酸-乙腈（1∶9）沉淀后，取上清液進(jìn)行色譜分析。采用Zorbax SBC18為色譜柱，以乙腈-0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀（15∶85，v/v，磷酸調(diào)pH=3.0）為流動(dòng)相，檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm，流速：0.8 mL·min-1，進(jìn)樣量：30 μL。結(jié)果：對(duì)46例長(zhǎng)期（＞1年）服用硫酸羥氯喹（200 mg· d-1）的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血藥谷濃度進(jìn)行檢測(cè)分析。羥氯喹在10～3000 ng·mL-1線性關(guān)系良好，批內(nèi)、批間精密度RSD均小于8.6%，全血及血清樣品的提取回收率分別為74.5%～78.6%和80.7%～85.4%。患者平均全血/血清谷濃度分別為（707.6±398.4）ng·mL-1、（282.2±153.8）ng·mL-1。結(jié)論：本法操作簡(jiǎn)便，靈敏，準(zhǔn)確度高，適用于羥氯喹血藥濃度檢測(cè)及藥效學(xué)研究。

羥氯喹；高效液相色譜法；血清；全血；系統(tǒng)性紅斑狼瘡

羥氯喹（hydroxychloroquine，HCQ）是4-氨基喹諾酮類的抗瘧藥，對(duì)慢性類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及系統(tǒng)性紅斑狼瘡（systemic lupus erythematosus，SLE）等疾病療效確切[1]。雖然長(zhǎng)期服用羥氯喹有可能會(huì)引發(fā)一些眼科疾病[2]，但相對(duì)其治療優(yōu)勢(shì)，羥氯喹仍然在SLE治療中占有重要地位。

羥氯喹半衰期長(zhǎng)，可長(zhǎng)期用藥，但個(gè)體差異較大[3-4]，關(guān)于羥氯喹濃度與藥效關(guān)系的研究仍然存在眾多爭(zhēng)議[5-6]。由于口服羥氯喹后，藥物迅速在眼、腎、肝、肺等器官分布。全血中濃度高于血清濃度，因血清濃度常受取血時(shí)間及離心時(shí)長(zhǎng)影響而改變[7-9]，在過往研究中多以全血為研究對(duì)象。本試驗(yàn)所建立的HPLC-DAD法檢測(cè)羥氯喹，易于普及，操作更為簡(jiǎn)單，且通過優(yōu)化的色譜條件與前處理方法，可同時(shí)對(duì)全血及血清中羥氯喹的濃度進(jìn)行檢測(cè)，能滿足臨床對(duì)羥氯喹血藥濃度控制的需求。

1 儀器與試藥、試劑

Agilent 1100 Series高效液相色譜儀 （含G1322A脫氣閥，G1312A泵，G1367B進(jìn)樣器，G1330B柱溫箱，G1316A紫外檢測(cè)器）。

硫酸羥氯喹對(duì)照品 （批號(hào)100582-200401）、內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚對(duì)照品（批號(hào)100018-200408）均由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。甲醇、乙腈為色譜純；其余試劑為分析純；水為純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Zorbax SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.2 mol·L-1磷酸二氫鉀（15∶85，v/v，磷酸調(diào)pH=3.0）；檢測(cè)波長(zhǎng)：254 nm；柱溫：35℃；流量：0.8 mL·min-1；進(jìn)樣體積：30 μL。

2.2 全血及血清樣品處理

全血樣品：反復(fù)振搖混勻后取全血樣品200 μL置于1.5 mL離心管中，加10%甲酸-乙腈 （1∶9）400 μL，振蕩渦旋3次，每次15 s，14000 r·min-1離心6 min，取上清液30 μL進(jìn)樣分析。

血清樣品：取血清樣品200 μL，參照全血樣品處理方法操作，進(jìn)行HPLC法分析。

2.3 專屬性試驗(yàn)

在 “2.1”色譜條件下羥氯喹保留時(shí)間為5.69 min，內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚保留時(shí)間為6.82 min，兩者峰形良好，其雜質(zhì)峰對(duì)樣品測(cè)定均無干擾（見圖1）。

2.4 線性關(guān)系考察

精密稱取硫酸羥氯喹13.01 mg（相當(dāng)于羥氯喹10.13 mg），置于10 mL量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻，即得濃度為1.013 mg·mL-1的羥氯喹儲(chǔ)備液。分別在6份200 μL空白血清中，加入一定量的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，配成含羥氯喹濃度分別為10、30、100、300、1000、3000 ng·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血清。按“2.2”項(xiàng)下方法操作，同時(shí)制備空白樣品，進(jìn)行HPLC法分析，制備標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算羥氯喹峰面積As和內(nèi)標(biāo)峰面積Ai的比值f（f=As/Ai），以峰面積比值f對(duì)血藥濃度C（ng·mL-1）作權(quán)重回歸，得羥氯喹回歸方程：血清：f1=1.404×10-3C+1.214×10-3（r=0.9991）；全血：f2=2.280×10-3C-1.705×10-2（r=0.9988）；權(quán)重系數(shù)w=1/C2。結(jié)果顯示，羥氯喹血清及全血濃度在10～3000 ng·mL-1線性關(guān)系均良好，最低定量限為10 ng·mL-1，信噪比大于10。

圖1 羥氯喹及內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚液相色譜圖

2.5 精密度和準(zhǔn)確度試驗(yàn)

制備含羥氯喹濃度分別為25、250、2500 ng· mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血樣，每個(gè)濃度各配制5份樣品，計(jì)算批內(nèi)精密度（日內(nèi)RSD）；連續(xù)測(cè)定3個(gè)分析批樣品，每批作隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算日間精密度（日間RSD）；以加樣回收率作為準(zhǔn)確度。結(jié)果見表1。

2.6 提取回收率試驗(yàn)

配制并處理含羥氯喹濃度為25、250、2500 ng· mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥血樣，每個(gè)濃度5份，作為回收率樣品；另取5份不同來源的空白全血、血清，同法處理，取沉淀后上清液，加入羥氯喹和內(nèi)標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)溶液，配制同上述3個(gè)質(zhì)量濃度的標(biāo)準(zhǔn)含藥血樣，每個(gè)濃度平行5份，作為測(cè)定回收率的對(duì)照樣品。將上述樣品進(jìn)樣，記錄色譜圖，回收率樣品峰面積與相應(yīng)對(duì)照品峰面積均值之比即為提取回收率。測(cè)得全血、血清中內(nèi)標(biāo)對(duì)乙酰氨基酚的提取回收率分別為（98.3±2.2）%和（65.7±2.4）%，全血及血清中羥氯喹提取回收率符合生物樣品分析要求，結(jié)果見表1。

表1 全血及血清中羥氯喹的精密度、準(zhǔn)確度和回收率（n=5）

2.7 穩(wěn)定性試驗(yàn)

制備含羥氯喹濃度分別為 25、250、2500 ng· mL-1的標(biāo)準(zhǔn)含藥全血、血清數(shù)份，其中3份按“2.2”項(xiàng)下操作處理后，立即進(jìn)樣測(cè)定并放入進(jìn)樣器中，分別于室溫下放置6 h、反復(fù)凍融及冷凍放置3周條件下測(cè)定其穩(wěn)定性，同時(shí)考察待測(cè)樣品溶液在進(jìn)樣器中的穩(wěn)定性。結(jié)果見表2。羥氯喹全血及血清樣品穩(wěn)定性均較好。

表2 HPLC法測(cè)定全血及血清中羥氯喹的穩(wěn)定性試驗(yàn)（n=3）

2.8 血藥濃度的測(cè)定

將本法用于本院風(fēng)濕免疫科46例口服硫酸羥氯喹片的系統(tǒng)性紅斑狼瘡患者的血藥濃度檢測(cè)。每位患者的持續(xù)服藥時(shí)間超過1年，服藥劑量為200 mg· d-1。谷濃度標(biāo)本為當(dāng)天患者服藥前抽取[4]。患者平均全血和血清谷濃度分別為 （707.6±398.4）ng·mL-1、（282.2±153.8）ng·mL-1，全血及血清中藥物濃度差異均較大，兩者濃度比值為40.9%（19.8%～77.5%）。

3 結(jié) 論

本實(shí)驗(yàn)中采取了2倍體積的甲酸-乙腈（1∶9）沉淀的方式，在提高沉淀效率的同時(shí)并不延長(zhǎng)處理時(shí)間，每個(gè)樣品從前處理到分析，總時(shí)長(zhǎng)控制在10 min以內(nèi)。此前處理方法最低檢測(cè)限可達(dá)10 ng·mL-1。為了防止Tett等[7]提出的離心時(shí)長(zhǎng)對(duì)羥氯喹血清藥物濃度可能造成的影響，本實(shí)驗(yàn)在前處理過程中對(duì)每一步離心的時(shí)長(zhǎng)做了考察，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)全血離心制備血清樣品時(shí)，若離心時(shí)長(zhǎng)為1～5 min，最終測(cè)定濃度確實(shí)會(huì)因離心時(shí)間增加而提高，提示必須充分離心，使細(xì)胞內(nèi)外達(dá)到一定平衡時(shí)，所測(cè)血清濃度較為恒定、準(zhǔn)確。因此最終選擇離心時(shí)長(zhǎng)為8 min。

從測(cè)得的患者羥氯喹全血及血清谷濃度結(jié)果看出，長(zhǎng)期服用相同劑量羥氯喹（200 mg·d-1）的SLE患者，個(gè)體血藥濃度差異較大，這與文獻(xiàn)報(bào)道結(jié)果相同[3]。引起濃度差異較大的原因：（1）可能與羥氯喹在體內(nèi)受多種肝細(xì)胞色素P450酶CYP2D6、2C8、3A4/5代謝相關(guān)，不同個(gè)體代謝酶的差異會(huì)使血中羥氯喹濃度不同。（2）大部分緩解病情抗風(fēng)濕藥（DMRADs）如甲氨蝶呤、柳氮磺胺吡啶、來氟米特、羥氯喹均是ABCG2[多藥耐藥機(jī)制相關(guān)的藥物排出泵（MDR）——三磷酸腺苷結(jié)合轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（ABC）G超家族成員2，MDR-ABC轉(zhuǎn)運(yùn)體中的一種]的底物，患者體內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)體的活性差異也是造成羥氯喹血藥濃度個(gè)體差異較大的原因。

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An HPLC Method for the Determination of Hydroxychloroquine in Both Serum and Blood Samples and Its Application in SLE Patients

LUO Xue-mei1,SI Hui-min2,YAO Yao1,GE Wei-hong1*
1Department of Medication;2Department of Rheumatology,the Affiliated Drum Tower Hospital of Nanjing University Medical School,Nanjing 210008,China

Objective:In this study,a rapid and precise HPLC method for the determination of hydroxychloroquine in human blood and serum samples has been developed for further study.Methods:After simple deproteinization with two-fold volume of formic acid-acetonitrile(1∶9)the supernatants of the samples were assessed by HPLC.Chromatographic separation was performed on a Zorbax SB-C18column using the mobile phase of acetonitrile-0.2 mol·L-1KH2PO4(15∶85,v/v,pH was adjusted by H3PO4to 3)at a flow rate of 0.8 min·L-1,and the detection wavelength was 254 nm.The method was applied in the determination of hydroxychloroquine in blood/serum samples from 46 patients with systemic lupus erythematosus (SLE)after oral administration of 200 mg·d-1sulfate hydroxychloroquine for more than 1 year.Results:The calibration curves were linear over the range of 10-3000 ng·mL-1.The RSD of intra-day and inter-day precision and accuracy for hydroxychloroquine were within 8.6%.The average recoveries of hydroxychloroquine in blood and serum were 74.5%-78.6%and 80.7%-85.4%,respectively.The average trough blood and serum concentrations of hydroxychloroquine were(707.6±398.4)ng·mL-1and(282.2±153.8)ng·mL-1,respectively.Conclusion:The method can be used as an effective approach in clinic and research fields.

Hydroxychloroquine;HPLC;Serum;Blood;Systemic lupus erythematosus(SLE)

R969.1

A

1673-7806（2015）06-562-03

羅雪梅，女，藥師 E-mail:yixuejiai@sina.com

*通訊作者葛衛(wèi)紅，女，主任藥師，碩士生導(dǎo)師E-mail:6221230@sina.com

2015-02-13

2015-02-26