氯化釓對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及凋亡的影響

陳　娜，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢　430060)

氯化釓對(duì)胃癌MGC-803細(xì)胞增殖及凋亡的影響

陳娜，徐細(xì)明

(武漢大學(xué)人民醫(yī)院腫瘤中心，湖北 武漢430060)

摘要：目的觀察氯化釓(Gdcl3)對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖及凋亡的影響。方法實(shí)驗(yàn)設(shè)對(duì)照組、10 μmol·L-1Gdcl3處理組及100 μmol·L-1Gdcl3處理組。不同濃度的Gdcl3對(duì)MGC-803處理24 h后，用MTT比色法觀察Gdcl3對(duì)細(xì)胞活性的影響；用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率；用Caspase活性檢測(cè)試劑盒來(lái)檢測(cè)細(xì)胞Caspase3，8，9活性檢測(cè)。結(jié)果與空白對(duì)照組相比，Gdcl3抑制MGC-803增殖，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義差異(P<0.05)；Gdcl3促進(jìn)MGC-803凋亡(P<0.05)；Gdcl3可增強(qiáng)MGC-803細(xì)胞Caspase-3，9的活性(P<0.05)，對(duì)Caspase-8影響不明顯。結(jié)論Gdcl3抑制MGC-803增殖，促進(jìn)癌細(xì)胞凋亡，可能主要通過(guò)線粒體途徑來(lái)促凋亡。

關(guān)鍵詞:胃癌；氯化釓；增殖；凋亡；Caspase-3；Caspase-9

胃癌的發(fā)生是一個(gè)多步驟、多因素進(jìn)行性發(fā)展的過(guò)程。在正常情況下，胃黏膜上皮細(xì)胞的增殖和凋亡之間保持動(dòng)態(tài)平衡。當(dāng)胃上皮細(xì)胞過(guò)度增殖又不能啟動(dòng)凋亡信號(hào)時(shí)就可能逐漸進(jìn)展為胃癌。Caspase是一組存在于細(xì)胞質(zhì)中具有類似結(jié)構(gòu)的蛋白酶，與真核細(xì)胞凋亡密切相關(guān)，并參與細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化與凋亡調(diào)節(jié)。

釓是一種稀土金屬元素，在醫(yī)療應(yīng)用方面可作為核磁共振的顯影劑來(lái)提高對(duì)一些癌癥轉(zhuǎn)移成像診斷的檢測(cè)水平[1-3]。除此，釓離子可提高臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞體外血管形成能力[4]，對(duì)糖尿病模型小鼠有降血糖作用[5]，對(duì)肝臟缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[6-7]，對(duì)肺損傷細(xì)胞有保護(hù)作用[8]，還可提高成纖維細(xì)胞NIH3T3的存活率[9]。釓離子絡(luò)合物還可抑制惡性膠質(zhì)瘤細(xì)胞及肝癌細(xì)胞的生長(zhǎng)[10-11]。尤其是釓離子納米顆粒具有一定的抗腫瘤活性[12-13]。

然后，有關(guān)釓離子對(duì)胃癌細(xì)胞MGC803增殖、凋亡的影響及其機(jī)制，還未見(jiàn)報(bào)道。我們將采用MTT、流式細(xì)胞術(shù)及Caspase活性檢測(cè)來(lái)檢測(cè)Gdcl3對(duì)胃癌細(xì)胞株MGC-803增殖、凋亡的影響及可能機(jī)制，探討Gdcl3在MGC-803凋亡中的作用機(jī)制。該研究有助于了解Gdcl3的生物學(xué)作用，并可能為胃癌的治療提供新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1細(xì)胞人胃癌細(xì)胞MGC-803由湖北醫(yī)藥學(xué)院實(shí)驗(yàn)中心提供。

1.1.2主要試劑RPMI-1640培養(yǎng)基購(gòu)自sigma公司；胎牛血清購(gòu)自杭州四季青生物有限公司；胰蛋白酶購(gòu)自GibcoBRL;MTT購(gòu)自武漢華瑞康科技有限公司；Annexin V-FICT/PI雙染細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華瑞康科技有限公司；Caspase-3,8,9活性檢測(cè)試劑盒購(gòu)自武漢華瑞康科技有限公司；Gdcl3購(gòu)自sigma公司。

1.1.3主要儀器CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(日本SANYO公司)，流式細(xì)胞儀(Becton Dickinson,美國(guó))，酶標(biāo)儀(美國(guó) Bio-Rad公司)。

1.2方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞MGC803培養(yǎng)在含10%胎牛血清的1640培養(yǎng)基中，常規(guī)培養(yǎng)條件37℃、5%CO2飽和濕度下，培養(yǎng)液中加有100 U·mL-1青霉素和100 U·mL-1鏈霉素。用0.25%胰酶進(jìn)行消化傳代，取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2MTT比色法檢測(cè)Gdcl3對(duì)MGC-803細(xì)胞活性的影響細(xì)胞分對(duì)照組和2個(gè)濃度的Gdcl3組，即10 μmol·L-1Gdcl3組和100 μmol·L-1Gdcl3組，培養(yǎng)至24 h時(shí)，細(xì)胞以5×106·L-1密度接種到96孔培養(yǎng)板中，每孔100 μL細(xì)胞培養(yǎng)液，每組6個(gè)復(fù)孔，每孔加5 g·L-1的MTT溶液15 μL[14]，然后繼續(xù)孵育4 h，吸棄掉培養(yǎng)液，每孔加入100 μL DMSO，輕輕振蕩混勻，用酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀測(cè)定光吸收值，測(cè)定波長(zhǎng)為570 nm，并以空白孔調(diào)零。

1.2.3流式細(xì)胞儀檢測(cè)Gdcl3對(duì)MGC-803細(xì)胞凋亡的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MGC-803細(xì)胞，消化成細(xì)胞懸液以1×106細(xì)胞數(shù)接種于培養(yǎng)瓶中，細(xì)胞貼壁后實(shí)驗(yàn)分組：空白對(duì)照組、10 μmol·L-1Gdcl3組、100 μmol·L-1Gdcl3組；分別處理24 h后，收集細(xì)胞，用PBS清洗2遍，棄上清；用400 uL 1×binding buffer懸浮細(xì)胞；加入5 μL的20 μg·L-1Annexin V-FITC，4°C避光孵育15 min；加入10 μL的 25 mg·L-1PI ，4°C避光孵育5 min，通過(guò)流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.4Caspase-3，8，9活性檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)同“1.2.1”，不同濃度Gdcl3作用MGC803到24 h后，參照Caspase-3，8，9活性檢測(cè)試劑盒步驟操作，最后用酶標(biāo)儀測(cè)定波長(zhǎng)為400 nm的吸光值，以此來(lái)表示Caspase-3，8，9活性大小。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞活性力變化不同濃度的Gdcl3對(duì)MGC-803處理24 h后，10 μmol·L-1Gdcl3對(duì)癌細(xì)胞的增殖抑制作用不明顯(P=0.909>0.05)，Gdcl3濃度升高至100 μmol·L-1，MGC-803增殖率會(huì)明顯被抑制(P=0.000<0.05)(表1，F(xiàn)=28.009，P=0.000)。

表1　人胃癌細(xì)胞MGC-803在不同濃度Gdcl3處理24 h

注：與對(duì)照組相比,*P<0.05。

2.2細(xì)胞凋亡率變化流式細(xì)胞結(jié)果如圖1(F=171.338，P=0.000)，不同濃度Gdcl3處理組對(duì)MGC-803作用24 h后，各組間凋亡率兩兩比較，與正常對(duì)照組(6.54±1.04)相比，10 μmol·L-1濃度組(8.07±1.49)沒(méi)有顯著差異(P=0.368>0.05)， Gdcl3濃度升高到100 μmol·L-1時(shí)，MGC-803凋亡率會(huì)顯著增高(P=0.000<0.05)，癌細(xì)胞的凋亡率達(dá)(33.65±4.59)。

2.3細(xì)胞Caspase-3，8，9活性的變化結(jié)果如表2所示，兩個(gè)濃度Gdcl3組Caspase-3活性均比對(duì)照組高，且有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P<0.05)。而且三個(gè)濃度組間兩兩比較，Caspase-3活性也有差異(P<0.05)，提示Gdcl3對(duì)細(xì)胞Caspase-3活性具有濃度依賴性的增強(qiáng)作用。而關(guān)于Caspase-8活性的變化，只有在Gdcl3濃度達(dá)100 μmol·L-1時(shí)與對(duì)照組相比才有差異(P<0.05)。Caspase-9活性的變化與Caspase-3活性變化趨勢(shì)相似。可見(jiàn)，Gdcl3主要是通過(guò)影響Caspase-3和Caspase-9的活性變化來(lái)影響MGC-803凋亡。

3討論

細(xì)胞凋亡是由于內(nèi)外環(huán)境的變化或死亡信號(hào)的觸發(fā)，在相關(guān)基因的調(diào)控下所發(fā)生的一系列細(xì)胞主動(dòng)死亡的過(guò)程。近年來(lái)有關(guān)釓離子具有一定的抗腫瘤時(shí)有報(bào)道[10-13]，但釓離子對(duì)胃癌細(xì)胞凋亡及增殖的影響，尚未見(jiàn)報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)MTT法測(cè)得Gdcl3能明顯抑制胃癌細(xì)胞MGC803的增殖，通過(guò)流式細(xì)胞術(shù)測(cè)得Gdcl3能誘導(dǎo)MGC803的凋亡。

按細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路來(lái)分，目前認(rèn)為，細(xì)胞凋亡信號(hào)傳導(dǎo)通路包括內(nèi)源性途徑(也稱線粒體凋亡途徑),外源性途徑(也稱死亡受體凋亡途徑)及內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑。死亡受體途徑主要是由于死亡受體與其相應(yīng)配體結(jié)合后，細(xì)胞內(nèi)發(fā)生一系列的反應(yīng)，最后激活下游的Caspase-3、6和7,導(dǎo)致細(xì)胞凋亡[14]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)途徑主要是由于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的caspase-12,同時(shí)也導(dǎo)致胞質(zhì)Caspase-7轉(zhuǎn)移到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)表面激活Caspase-12,繼而激活Caspase-9,進(jìn)入Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，最終引起細(xì)胞凋亡[14-15]。線粒體途徑是由于線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔開放，并啟動(dòng)Caspase級(jí)聯(lián)反應(yīng)，激活下游的Caspase-3和Caspase-7，完成相應(yīng)底物的剪切，引起內(nèi)皮細(xì)胞死亡和凋亡[15]。

表2　不同濃度Gdcl 3對(duì)MGC-803作用24 h后細(xì)胞Caspase-3,8,9活性變化的影響

有關(guān)Gdcl3誘導(dǎo)MGC803凋亡機(jī)制尚未見(jiàn)報(bào)道。我們通過(guò)檢測(cè)Caspase-3、8、9的活性變化，不同濃度Gdcl3對(duì)MGC803作用24h后，與對(duì)照組相比，Caspase-3和9的活性明顯增高，此結(jié)果提示Gdcl3誘導(dǎo)MGC803凋亡可能主要是先通過(guò)激活Caspase-9，然后導(dǎo)致下游的Caspase-3的激活，最后由Caspase-3來(lái)實(shí)現(xiàn)細(xì)胞凋亡，即Gdcl3主要通過(guò)激活線粒體途徑來(lái)促使MGC803凋亡的發(fā)生。

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(收稿日期：2015-03-09，修回日期：2015-04-30)

通信作者：徐細(xì)明，男，主任醫(yī)師，碩士生導(dǎo)師，研究方向：消化系統(tǒng)惡性腫瘤的基礎(chǔ)與臨床，E-mail：doctorxu120@yahoo.com.cn

作者簡(jiǎn)介：陳娜，女，碩士研究生

doi:10.3969/j.issn.1009-6469.2015.09.056