膀胱感覺和運動神經支配的大鼠模型的建立及鑒定

趙建國　雷德橋　蒙德鵬　侯春林　林浩東　宗海洋　陳寅生　蔡雨衛

(第二軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海　200003)

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·論著·

膀胱感覺和運動神經支配的大鼠模型的建立及鑒定

趙建國雷德橋蒙德鵬侯春林林浩東宗海洋陳寅生蔡雨衛

(第二軍醫大學附屬長征醫院骨科，上海200003)

摘要目的：建立重建膀胱感覺和運動神經支配的SD大鼠模型并進行鑒定，為進一步研究排尿中樞重塑及其機制奠定基礎。方法： 45只雌性SD大鼠隨機分為對照組(n=10)、神經根切斷組(n=15)和神經根吻合組(n=20)。神經根切斷組大鼠，將L4以下雙側脊神經前后根全部切斷；神經根吻合組在切斷脊神經根后，將雙側L4神經前后根與S1相應神經根吻合；對照組不作手術處理。術后6個月，取各組大鼠，分別行尿流動力學檢測、神經根電刺激、神經吻合口甲苯胺藍染色、盆神經節注射熒光金神經示蹤染色和膀胱濕質量測量。結果：神經根吻合組大鼠膀胱最大容量、殘余尿量、膀胱順應性及膀胱濕質量均小于神經根切斷組而大于對照組(P<0.05)；神經根吻合組大鼠最大排尿壓與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，但大于神經根切斷組(P<0.05)。神經根吻合組電刺激神經根后膀胱內壓升高，但低于對照組(P<0.05)。神經根吻合組神經吻合口甲苯胺藍染色可見神經纖維通過率達(53.4±6.7)%。盆神經節內注射熒光金后，神經根吻合組可見L4脊髓節段雙側灰質熒光金染色，神經根切斷組和對照組未在相應脊髓節段檢測到熒光金染色。結論：成功建立了同時重建膀胱感覺及運動神經支配的大鼠動物模型，為進一步研究排尿中樞重塑及其機制奠定了基礎。

關鍵詞尿流動力學；神經吻合；神經重塑；神經示蹤；神經根電刺激

脊髓是排尿反射的低級中樞，也是膀胱感覺及運動信息與腦部高級排尿中樞聯系的通道。脊髓損傷常造成排尿功能障礙，嚴重影響患者的生活質量，相關并發癥是導致截癱患者死亡的主要原因[1]。經神經途徑的膀胱功能重建有望改善和恢復膀胱功能，實現意識控制下的自主排尿。但以往研究一般僅重建膀胱的運動功能，忽視了膀胱感覺功能的重建。為了形成自身對照，在動物實驗中常行單側神經根吻合，這與臨床上患者的實際傷情并不一致。由于膀胱運動神經和感覺神經失去聯系，僅僅重建膀胱運動神經通路難以形成真正的排尿反射，排尿低級中樞和高級中樞更難以發生移位和重塑[2]。因此，本實驗同時重建大鼠膀胱的雙側感覺及運動神經支配，并通過尿流動力學、神經根電刺激、盆神經節注射熒光金神經示蹤染色、吻合口甲苯胺藍染色等方法對動物模型進行鑒定，為下一步研究排尿中樞的重塑及機制奠定了基礎。

1資料與方法

1.1實驗動物及分組清潔級雌性SD大鼠共45只，購自復旦大學醫學院實驗動物中心，體質量為180～210 g，5~6周齡。隨機分為對照組(n=10)、神經根切斷組(n=15)和神經根吻合組(n=20)。

1.2主要材料、試劑和儀器膀胱造瘺管(以外徑為1 mm的硬膜外麻醉導管制作)；顯微手術器械(北京中興名業科技發展有限責任公司)；WZ-50C6型微量注射泵(浙江大學儀器有限公司)；熒光金(美國Biotium公司)；1%戊巴比妥鈉(上海山浦化工有限公司)；M6240B多通道生理記錄儀[成都儀器廠(股份合作)]；手術顯微鏡(上海精密儀器儀表有限公司)；甲苯胺藍試劑(上海聰誠實業有限公司)。

1.3動物模型的建立神經根切斷組：以1%戊巴比妥鈉(40 mg/kg)行腹腔注射麻醉后，將SD大鼠俯臥位固定于鼠板上，剃毛、消毒，取后正中切口依次切開皮膚、皮下及深筋膜，顯露棘突，向兩側鈍性剝離骶脊肌，顯露椎板，依次定位各脊椎平面。在10倍手術顯微鏡下，應用顯微持針器自L3脊椎節段至S3節段咬除棘突及椎板，剪開硬脊膜，暴露脊髓及馬尾神經。將L4以下所有脊神經剪斷，逐層縫合切口。神經根吻合組：暴露脊髓和馬尾神經后，根據椎間孔定位找到L4和S2神經根；后根較粗，可分為2束；前根較細，為1束。將L4神經根自椎間孔處剪斷，同水平剪斷S1神經根，將雙側L4神經前后根與S1神經相應前后根用12-0顯微縫合線吻合。L4以下其余神經根全部剪斷。對照組不作任何手術處理。

神經根吻合組及神經根切斷組大鼠麻醉蘇醒后，腹腔注射慶大霉素0.5 mg/kg，1次/d，共3 d。在通風良好的條件下分籠飼養1周后合籠，每天2次Credé手法腹部按摩以排除殘余尿，自由攝食、飲水。術后6個月進行相應指標檢測。

1.4尿流動力學檢測將各組大鼠以1%戊巴比妥腹腔注射麻醉后，仰臥位固定于鼠板上，下腹部剃毛后行正中切口，依次切開腹部皮膚、皮下組織、腹肌、腹膜，暴露膀胱。尿道插入20 G靜脈留置針，注入0.9%氯化鈉液使膀胱充盈，于膀胱頂部用4-0絲線預置2道荷包縫線后，剪開小口造瘺，將外徑為1 mm的膀胱造瘺管插入膀胱，收緊荷包縫合線后打結。拔出靜脈留置針，向造瘺管內注入0.9%氯化鈉液，見尿道外口有尿液流出而吻合口無滲漏，則證明膀胱造瘺成功。將造瘺管通過三通管分別連接微量注射泵和壓力換能器，壓力換能器與M6240B多通道生理信號儀連接。以9 mL/h速度向膀胱內灌注溫度為37 ℃的0.9%氯化鈉液，測量壓力容積曲線，至尿道外口有尿液流出時停止灌注，此時灌注量為最大膀胱容量，尿道口排出尿液體積為排尿量，以灌注量減去排出量為殘余尿量。

1.5神經根電刺激神經根吻合組大鼠及對照組大鼠俯臥位固定，行后正中切口，暴露吻合神經根和S1神經根，用刺激電極勾住神經根，刺激電極與M6240B多通道生理記錄儀連接，采用正電流電刺激(電流強度5 mA，頻率20 Hz，脈沖寬度為 0.3ms,持續時間為5 s)，向膀胱內注射0.9%氯化鈉液至最大膀胱容量，記錄電刺激時膀胱壓力變化。

1.6盆神經節注射熒光金神經示蹤染色取各組大鼠以微量注射器向盆神經節內注入5%熒光金10 μL，留針5 min，縫合切口，1周后處死大鼠。經 0.9%氯化鈉液和4%多聚甲醛灌注固定，脊髓取材，OCT包埋，切片，厚度30 μm，在熒光顯微鏡下觀察脊髓染色情況。

1.7神經根吻合口甲苯胺藍染色神經根吻合組大鼠經0.9%氯化鈉液及4%多聚甲醛灌注固定后，以吻合口為中心，剪取1 cm吻合神經，行甲苯胺藍染色，根據吻合口兩側神經纖維的數量計算神經纖維通過率。

1.8膀胱濕質量測量處死各組大鼠后，經0.9%氯化鈉液及4%多聚甲醛灌注固定，切取膀胱，用分析天平準確稱取膀胱濕質量。

1.9統計學處理采用SPSS 16.0統計軟件進行統計學分析，計量資料行正態分布檢驗，符合正態分布的，組間比較采用t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

神經根吻合組20只大鼠全部手術成功，術后6個月有4只大鼠因尿路反復感染、血尿而死亡。存活的16只大鼠中10只行尿流動力學檢測，然后解剖神經根吻合口。由于吻合神經與周圍組織粘連，僅6只大鼠完整分離出神經吻合，行神經根電刺激，之后處死，取吻合口行甲苯胺藍染色，計算神經纖維通過率，再切取膀胱進行濕質量測量。神經根吻合組中其余6只大鼠行熒光金示蹤染色。神經根切斷組15只大鼠全部手術成功，術后6個月有3只死于尿路反復感染；存活的12只大鼠中6只行尿流動力學檢測和膀胱濕質量測量，6只在盆神經節內注射熒光金、行神經示蹤檢測。對照組10只大鼠全部存活，其中5只行尿流動力學檢測，并行神經根電刺激，之后處死行膀胱濕質量測量；其余5只行熒光金示蹤染色。

2.1尿流動力學檢測結果術后6個月，神經根吻合組大鼠膀胱最大容量、殘余尿量及膀胱順應性均小于神經根切斷組而大于對照組(P<0.05)；神經根吻合組大鼠最大排尿壓與對照組比較差異無統計學意義(P>0.05)，而大于神經根切斷組(P<0.05)，見表1。壓力容積曲線檢測見神經根切斷組呈一平滑曲線，排尿時無明顯的壓力波動；而神經根吻合組在排尿時出現明顯的壓力波動，與對照組相似，見圖1。

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注：與神經根切斷組比較，#P<0.05；與對照組比較，*P<0.05

A：神經根切斷組；B：神經根吻合組；C：對照組

2.2神經根電刺激檢測結果神經根吻合組行神經根吻合口電刺激，可見膀胱內壓明顯升高，為(10.06±2.58)cmH2O，略低于對照組[(17.06±3.69)cmH2O]，差異有統計學意義(P<0.05)，見圖2。

2.3熒光金示蹤檢測結果神經根吻合組可見L4脊髓雙側灰質均有熒光金染色，而神經根切斷組和對照組在L4脊髓均未見熒光金染色，見圖3。

2.4神經根吻合口甲苯胺藍染色結果神經根吻合組見吻合口近端神經纖維較多，排列較整齊，而吻合口遠端可見神經較少，排列較紊亂，神經纖維通過率為(53.4±6.7)%，見圖4。

A：神經根吻合組；B：對照組

A神經根吻合組，金黃色亮點為熒光金染色；B為神經根切斷組L4脊髓節段熒光金染色，為陰性；C為正常大鼠L4脊髓節段熒光金染色，為陰性

圖3熒光顯微鏡下熒光金示蹤染色脊髓圖像(×100)

A：吻合口神經纖維；B：吻合口近端神經纖維；C：吻合口遠端神經纖維

2.5膀胱濕質量測量結果神經根切斷組膀胱濕質量明顯增大，為(1.804±0.612)g，顯著大于神經根吻合組[(0.502±0.166)g]和對照組[(0.095±0.026)g],P<0.05；神經根吻合組膀胱濕質量大于對照組，差異有統計學意義(P<0.05)。

3討論

脊髓損傷造成的膀胱功能障礙不但嚴重影響患者的生活質量，而且可以引發泌尿系結石、感染甚至腎功能衰竭，威脅患者的生命，是臨床醫學亟待解決的難題[3]?；謴秃透纳瓢螂坠δ艿耐饪浦委熤饕ò螂讛U大術、尿道括約肌切開術、周圍肌肉代膀胱逼尿肌手術、骶神經切斷術、骶神經前根電刺激術等。這些方法可在一定程度上改善膀胱的排尿和儲尿功能，但手術創傷大，失敗率高，適用范圍窄，不能從根本上恢復膀胱神經支配，臨床效果不佳[4]。重建膀胱的神經支配、恢復膀胱與排尿中樞的神經通路、實現意識支配下的排尿功能才是治愈脊髓損傷后排尿功能重建的根本途徑[5]。

目前經神經途徑重建膀胱功能的研究主要包括：體神經膀胱逼尿肌內種植、體神經與盆神經吻合、脊髓損傷平面上下神經根吻合、利用脊髓損傷平面下方殘存的體反射重建膀胱排尿反射等[6]。然而，這些研究只重視重建膀胱的運動通路，而忽視了感覺通路的重建，重建的運動中樞與感覺中樞失去聯系，難以形成排尿反射，更難以在腦部高級部位形成排尿反射的重塑，并非真正意義上的排尿反射重建，因而無法形成有意識的排尿控制，給患者生活帶來了極大的不便[2]。此外，為形成自身對照，以往研究常完整保留一側膀胱神經支配，而對另一側膀胱支配神經進行重建，這與臨床上患者的實際傷情有較大區別。因此，本研究將SD大鼠軀體神經的前、后根與支配膀胱的內臟神經前后根雙側吻合，同時重建了膀胱的運動和感覺功能。這一動物模型與臨床患者的傷情更相似，也更有利于排尿反射的重建和不同水平膀胱排尿中樞的重塑。

本研究用大鼠構建膀胱功能重建的動物模型，不僅因為大鼠具有經濟、易于管理等優點，更在于大鼠的排尿反射與人類相似度高，且目前相關研究多以大鼠為模型，對大鼠的解剖和生理情況的認識深入系統，可供借鑒[7]。由于雄性大鼠導尿和術后人工排尿困難，而尿液可反流入精囊，影響膀胱內壓測量的準確性[8]，故本研究均采用雌性大鼠。大鼠膀胱內壓的測量有經尿道插管和膀胱造瘺兩種方法，由于膀胱尿道過細，選擇經尿道插管更增大了尿道的阻力，使膀胱容積和內壓明顯高于實際水平；而膀胱造瘺雖然手術復雜，但經過一段時間的反復練習可熟練掌握，尿流動力學測量更準確[9]。在脊髓節段和神經根選擇方面，前期的神經根電刺激實驗及相關報道顯示，支配大鼠膀胱的脊髓節段主要包括L6、S1、S2，其中又以L6和S1作用最強，電刺激L4和L5神經根沒有發現膀胱內壓發生明顯改變[10]。由于L5神經根分束多，每束直徑遠遠大于各骶神經根，吻合部位隨機性較大，結果重復率低，而且與L6脊髓節段接近、存在神經聯系，因此，本研究選擇以L4神經根作為近端神經根[11]。遠端選擇S1神經根的原因在于，動物解剖發現S1與L6神經所形成的神經干是盆神經的主要來源；而神經根電刺激實驗進一步從電生理方面驗證了S1神經是支配膀胱逼尿肌的主要神經根；且S1神經根與L4神經根直徑差異較小，可以實現無張力吻合而不需要行神經移植，簡化了手術操作，縮短了神經再生時間，保證了神經吻合口有較高的神經纖維通過率[12]。

術后6個月，神經根吻合口的甲苯胺藍染色發現，有一定比例的神經纖維從近端越過吻合口，說明近端軀體神經與遠端支配膀胱的內臟神經發生了聯系。盆神經節注射熒光金示蹤劑后，于雙側L4脊髓灰質檢測出熒光金染色，而神經根切斷組和對照組均未于L4節段見熒光金染色，說明支配膀胱的神經中樞已移位至L4軀體脊髓中樞，從形態學角度驗證了膀胱的排尿中樞在脊髓水平發生了重建[13]。本研究進行神經根電刺激時，神經根吻合組測到膀胱內壓明顯升高且大鼠發生排尿，膀胱內壓波形與對照組相似，說明吻合神經在功能上也是完整的。尿流動力學是鑒定膀胱功能的最重要的檢測手段，當膀胱內注入一定量的溫0.9%氯化鈉液，吻合神經根組膀胱內壓發生明顯變化，達到一定膀胱容量時則發生排尿，最大膀胱內壓及波形與對照組相近，說明膀胱具有良好的彈性和收縮功能[14]。而神經根切斷組的膀胱濕質量明顯增大，最大膀胱容量及殘余尿量顯著高于神經根吻合組及對照組，在膀胱充盈過程中膀胱內壓低，無明顯波動，呈高順應性膀胱，說明膀胱失去神經支配，無法形成排尿反射。失神經支配導致了膀胱營養代謝障礙，以致尿液持續充盈，又進一步加重膀胱的損傷，逼尿肌最終發生不可逆損傷而失去收縮功能。

綜上所述，本研究成功建立了同時重建膀胱感覺和運動神經支配的動物模型，并從形態學和功能學角度對這一模型進行了驗證，為進一步進行排尿中樞的重塑及機制的研究奠定了基礎。同時在研究中發現，神經根吻合組膀胱最大容量、殘余尿量、膀胱順應性、膀胱濕質量仍大于對照組，說明吻合神經后在等待神經長入的過程中膀胱已經發生了損傷，而神經吻合口的檢測發現，只有很少的神經纖維通過吻合口。因此，分析失神經支配后膀胱的損傷及機制、尋找逆轉這一病理變化的方法并促進神經纖維的生長也是后續實驗的重要內容。

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Establishment and Identification of Rat Model with Reconstruction of Bladder Sensory and Motor Innervation

ZHAOJianguoLEIDeqiaoMENGDepengHOUChunlinLINHaodongZONGHaiyangCHENYinshengCAIYuweiDepartmentofOrthopedics,ChangzhengHospital,TheSecondMilitaryMedicalUniversity,Shanghai200003,China

AbstractObjective：To establish and identify a SD rat model with reconstruction of bladder sensory and motor innervation, so as to lay the foundation for further study of micturition center remodeling and its mechanisms. Methods:A total of 45 female SD rats were randomly divided into control group(n=10),rhizotomy group(n=15) and nerve root anastomosis group(n=20). All the ventral and dorsal roots of spinal nerve below L4 level of rats in rhizotomy group were cut off.In nerve root anastomosis group, the bilateral ventral and dorsal roots of L4 nerve, were anastomosed with those of S1 nerve, after the spinal nerve roots had been cut off.Rats in control group were not treated with surgery. At Six months after surgery,rats in each group underwent urodynamic test,nerve root stimulation, toluidine blue staining at nerve anastomosis site,pelvic ganglia fluorescence gold tracer staining and bladder wet weight measurements. Results: Bladder maximum capacity,residual urine volume,bladder compliance and bladder wet weight in nerve root anastomosis group was less than those in rhizotomy group, however, larger than those in control group(P<0.05).There was no statistically significant difference in maximum voiding pressure between nerve root anastomosis group and control group(P>0.05), however, maximum voiding pressure in nerve root anastomosis group was larger than that in rhizotomy group(P<0.05).Intravesical pressure increased after nerve root stimulation in nerve root anastomosis group,but it was still lower than that in control group(P<0.05).Nerve passing rate was (53.4±6.7)% in nerve root anastomosis group, under toluidine blue staining at nerve anastomosis site. After injection of fluorescent gold in pelvic ganglia,fluorescence gold staining was visible in the L4 spinal cord gray matter in nerve root anastomosis group, however, not visible in rhizotomy group and control group. Conclusions: SD rat model with reconstruction of bladder sensory and motor innervation is successfully established. It lays the foundation for further study of micturition center remodeling and its mechanism.

Key WordsUrodynamics；Nerve anastomosis；Neural remodeling；Nerve tracer；Nerve root stimulation

通訊作者侯春林，E-mail：borealsky@163.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(編號：10JC1418300)

中圖分類號R334.3

文獻標識碼A