硫化氫通過P物質介導促進小鼠肺組織的神經源性炎性反應

趙倩　王長謙　喬建甌　張繪莉

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院　a心內科,b呼吸內科，上海　200011)

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·論著·

硫化氫通過P物質介導促進小鼠肺組織的神經源性炎性反應

趙倩a王長謙a喬建甌b張繪莉a

(上海交通大學醫學院附屬第九人民醫院a心內科,b呼吸內科，上海200011)

摘要目的：探討硫化氫對小鼠肺組織神經源性炎性反應的影響及其作用機制。方法： 飼養8周齡的雄性Balb/c小鼠，分別予以CP-96345(2.5 mg/kg，腹腔注射)、辣椒素(50 mg/kg，皮下注射)或capsazepine(15 mg/kg，皮下注射)預處理，然后隨機腹腔注射0.9%氯化鈉溶液或硫氫化鈉(NaHS；10 mg/kg)，即分為對照組、NaHS組、CP-96345+NaHS組、辣椒素+NaHS組和capsazepine+NaHS組。用藥1 h后處死小鼠，采用酶聯免疫吸附試驗(ELISA)法檢測血漿P物質以及肺組織勻漿中腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukine-1 beta，IL-1β)水平，并用四甲基聯苯胺反應液測定肺組織勻漿中髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性，通過HE染色法觀察肺組織的病理學變化。另選8周齡、雄性、前速激肽原A(pre-pro-totchykinin A，PPT-A)基因敲除小鼠(PPT-A-/-)和相同遺傳背景的同齡、野生型Balb/c小鼠(PPT-A+/+)，分別隨機腹腔注射0.9%氯化鈉液或NaHS(2.5 mg/kg)，1 h后處死小鼠，檢測肺組織勻漿中MPO活性、TNF-α和IL-1β水平，并觀察肺組織的病理學變化。結果：NaHS可顯著升高小鼠血漿P物質濃度(P<0.05)，提高肺組織勻漿中的MPO活性以及TNF-α和IL-1β水平(均P<0.05)，導致肺組織炎性損傷。敲除小鼠編碼P物質的PPT-A基因或者予以CP-96345、辣椒素或capsazepine預處理阻斷P物質信號通路后，NaHS不能顯著升高肺組織中MPO活性以及TNF-α和 IL-1β水平，與單純NaHS處理組相比差異有統計學意義(均P<0.05)；而且NaHS所致的肺組織損傷也明顯減輕。結論：硫化氫可能通過刺激神經末梢纖維釋放P物質，促進肺組織發生神經源性炎性反應，最終導致肺組織損傷。

關鍵詞硫化氫；炎性反應；P物質；肺損傷

當氣道或肺組織受到刺激時，感覺神經末梢會釋放P物質和降鈣素基因相關肽(calcitonin gene related peptide，CGRP)等神經肽，作用于多種效應細胞，如氣道平滑肌細胞、膽堿能神經節、炎性細胞和黏液腺等，導致血管通透性增高、氣道平滑肌收縮和組織水腫等，引起神經源性炎性反應，造成組織或器官損傷[1-2]。硫化氫是人體內發現的第3個氣體介質，與肺損傷的發生和發展密切相關[3-6]。然而，硫化氫誘導的肺損傷是否與神經源性炎性反應有關，目前尚不明確。本研究應用硫氫化鈉(NaHS)作為外源性硫化氫供體誘導肺損傷，觀察小鼠肺組織中神經源性炎性反應介質—P物質及其相關通路的變化情況，以明確硫化氫誘導肺損傷與神經源性炎性反應的關系。

1資料與方法

1.1材料NaHS、P物質信號通路相關拮抗劑(CP-96345、辣椒素、capsazepine)以及檢測髓過氧化物酶(myeloperoxidase，MPO)活性的四甲基聯苯胺反應液(tetramethyl benzidine，TMB)均購自美國Sigma公司；Cartrige C18色譜柱購自美國Bachem公司；檢測P物質的酶聯免疫吸附試驗(ELISA)試劑盒購自美國半島實驗室(Peninsula Laboratories)；檢測腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)和白細胞介素-1β(interleukine-1 beta，IL-1β)的ELISA試劑盒購自美國R&D公司。

1.2動物8周齡、雄性Balb/c小鼠共110只，體質量為20～24 g，購于中國科學院上海實驗動物中心，并在SPF級環境下飼養。8周齡、體質量為20～25 g、前速激肽原A(pre-pro-totchykinin A，PPT-A)基因敲除的雄性Balb/c小鼠(PPT-A-/-)共16只，由美國加州大學舊金山分校Basbaum教授惠贈，并在SPF級環境下飼養。

1.3給藥及分組將110只8周齡、雄性Balb/c小鼠隨機分為對照組、NaHS組、CP-96345+NaHS組、辣椒素+NaHS組和capsazepine+NaHS組。對照組和NaHS組小鼠腹腔分別注射 0.9%氯化鈉液0.1 mL或NaHS(10 mg/kg)，并于1 h后腹腔注射致死劑量(90 mg/kg)的苯巴比妥處死小鼠，每組10只小鼠；CP-96345+NaHS組小鼠腹腔注射CP-96345(2.5 mg/kg)，30 min后腹腔注射NaHS(10 mg/kg)，1 h后腹腔注射致死劑量的苯巴比妥處死小鼠，同時設未處理組和單純NaHS干預組作為對照，每組10只小鼠；辣椒素+NaHS組小鼠連續每天皮下注射辣椒素(50 mg/kg)，6 d后腹腔注射NaHS(10 mg/kg)，1 h后腹腔注射致死劑量的苯巴比妥處死小鼠，同時設未處理組和單純NaHS干預組作為對照，每組10只小鼠；capsazepine+NaHS組小鼠皮下注射capsazepine(15 mg/kg)，30 min后腹腔注射NaHS 10 mg/kg，1 h后腹腔注射致死劑量的苯巴比妥處死小鼠，同時設未處理組和單純NaHS干預組作為對照，每組10只小鼠。處死小鼠時留取血液標本，注入4 ℃抗凝管中，搖勻，于4 ℃以10 000 r/min速度離心10 min，分離血漿，保存于-80 ℃待測。同時，分離雙側肺組織，在液氮中速凍后，保存于-80 ℃待測。

8周齡、雄性PPT-A-/-小鼠和相同遺傳背景的同齡、野生型小鼠(PPT-A+/+)隨機分為PPT-A-/-+0.9%氯化鈉液組、PPT-A-/-+NaHS組、PPT-A+/++0.9%氯化鈉液組和PPT-A+/++NaHS組，前兩組每組8只，后兩組每組10只。PPT-A-/-和PPT-A+/+小鼠按分組情況腹腔注射0.9%氯化鈉液(0.1 mL)或NaHS(10 mg/kg)，1 h后腹腔注射致死劑量的苯巴比妥處死小鼠，然后分離血漿和雙側肺組織，保存于-80 ℃待測。

1.4ELISA法檢測血漿P物質濃度和肺組織勻漿中TNF-α、IL-1β 水平取小鼠血漿600 μL，通過Cartrige C18色譜柱吸附分離P物質，再以1.5 mL的75%乙腈溶液洗脫吸附的P物質，將洗脫物凍干后重新溶解于P物質Assay Buffer中。根據P物質ELISA檢測試劑盒說明書步驟測定血漿P物質濃度。血漿P物質的質量濃度單位為ng/mL。

取小鼠肺組織勻漿100 μL，按照ELISA試劑盒說明書步驟測定TNF-α和IL-1β水平。ELISA測定值除以肺組織勻漿DNA濃度即為肺組織勻漿中的TNF-α和IL-1β水平，單位為pg/μg DNA。

1.5TMB法測定肺組織勻漿MPO活性肺組織勻漿中MPO活性可用于評估肺組織中性粒細胞的浸潤情況。取小鼠肺組織50 mg，置于勻漿器中，加入1 mL磷酸鈉緩沖液(20 mmol/L，pH7.4)，冰浴勻漿后離心(13 000×g，10 min，4 ℃)。棄上清液，加入含0.5%十六烷基三甲基溴化銨(hexadecyl trimethyl ammonium bromide，HTAB)的磷酸鈉緩沖液(50 mmol/L，pH6.0)1 mL，混勻后反復凍融4次，并超聲粉碎2 min后離心(13 000×g，5 min，4 ℃)。取上清液50 μL，加入TMB反應液50 μL，混合物于37 ℃反應110 s后，加入0.18 mol/L的H2SO450 μL以終止反應，隨后立即在分光光度計405 nm波長下檢測反應物的吸光度。吸光度值除以肺組織勻漿中DNA濃度即為肺組織勻漿中的MPO活性。

1.6蘇木精-伊紅染色(hematoxylin-eosin staining)法觀察肺組織的病理學變化處死各組小鼠后，開胸取出肺臟，尋找氣管分叉，從右肺下葉取一塊肺組織，迅速放人10%中性甲醛溶液中固定24 h，然后進行石蠟包埋和HE染色，觀察肺組織損傷程度。

2結果

2.1NaHS對血漿P物質濃度和肺組織炎性反應的影響如表1和圖1所示，與對照組相比較，NaHS(10 mg/kg，腹腔注射)可顯著提高小鼠血漿P物質濃度、肺組織勻漿中的MPO活性以及肺組織勻漿中的TNF-α 和IL-1β水平(均P<0.05)，加重肺組織的炎性反應和肺損傷。光學顯微鏡下可見對照組小鼠的肺泡結構清晰完整；而NaHS組小鼠肺組織充血水腫，有大量炎性細胞浸潤，肺泡間隔明顯增寬、增厚，肺泡腔變窄甚至消失。

組別n血漿P物質/(ng/mL)肺MPO活性肺TNF-α/(pg/μgDNA)肺IL-1β/(pg/μgDNA)對照組100.0564±0.00871.00±0.162589.73±446.212428.99±362.12NaHS組100.0778±0.0111*1.48±0.33*3192.11±506.93*3210.72±482.20**

注：與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01.

圖1　光學顯微鏡下觀察NaHS干預對肺組織結構的影響(HE染色，×400)

2.2CP-96345、辣椒素或capsazepine預處理對NaHS誘導的小鼠肺組織炎性反應和肺損傷的影響為明確硫化氫是否通過促進P物質的釋放而引起肺損傷，本研究應用相關拮抗劑阻斷P物質信號通路后觀察NaHS對肺組織炎性反應和肺損傷的影響。部分小鼠分別予以神經激肽1(neurokinin 1，NK1)受體拮抗劑CP-96345預處理，阻斷小鼠P物質與NK1受體的結合；或予以辣椒素預處理，耗竭小鼠神經末梢P物質；或予以瞬時受體電位通道香草醛亞型1(transient receptor potential vanilloid type 1，TRPV1)受體選擇性阻斷劑capsazepine預處理，抑制神經末梢釋放P物質。然后，予以NaHS干預，再檢測肺組織中的細胞因子水平和肺損傷情況。結果如表2所示，CP-96345、辣椒素或capsaze-pine預處理并進行NaHS干預后，肺組織勻漿中MPO活性、TNF-α和IL-1β水平較單純NaHS干預組均顯著降低，差異有統計學意義(均P<0.05)。另一方面，如圖2所示，CP-96345、辣椒素或capsazepine預處理可顯著減輕NaHS引起的肺損傷，減少肺組織炎性細胞浸潤。

2.3NaHS對PPT-A-/-小鼠肺組織炎性反應和肺損傷的影響本研究進一步應用PPT-A-/-小鼠觀察了NaHS對肺組織炎性反應和肺損傷情況的影響。敲除編碼小鼠P物質的PPT-A基因后，小鼠血漿P物質濃度極低。腹腔注射10 mg/kg NaHS 1 h后，PPT-A-/-小鼠的肺MPO活性、肺TNF-α 和IL-1β水平均無明顯升高，且明顯低于野生型PPT-A+/+小鼠經NaHS處理后的相應水平(P<0.05)；顯微鏡下觀察發現，PPT-A+/++NaHS組小鼠肺組織的炎性反應和肺損傷情況亦不明顯。見表3、圖3。

表2　CP-96345、辣椒素或capsazepine預處理對NaHS誘導肺組織炎性反應的影響

注：△與單純NaHS干預組相比，P<0.05；*與未處理組相比，P<0.05

圖2　光學顯微鏡下觀察CP-96345、辣椒素或capsazepine預處理對NaHS誘導的肺損傷的影響(HE染色，×400)

組別n肺MPO活性肺TNF-α/(pg/μgDNA)肺IL-1β/(pg/μgDNA)PPT-A+/++0.9%氯化鈉液組101.00±0.265049.01±1186.713289.61±932.11PPT-A+/++NaHS組101.31±0.34*6755.39±990.50*5179.49±714.41*PPT-A-/-+0.9%氯化鈉液組81.00±0.334157.73±798.012755.09±785.60PPT-A-/-+NaHS組81.02±0.22△3944.98±798.59△3091.38±422.78△

注：*與PPT-A+/++0.9%氯化鈉液組相比，P<0.05；△與PPT-A+/++NaHS組相比，P<0.05

圖3　光學顯微鏡下觀察NaHS干預對PPT-A-/-小鼠肺組織結構的影響(HE染色，×400)

3討論

氣道非腎上腺素能非膽堿能(nonadrenergic noncholinergic，NANC)神經分布在各層氣道管壁，受到辣椒素、酸、煙霧和空氣污染物等刺激后迅速釋放速激肽類炎性介質，趨化炎性細胞浸潤并使其釋放炎性介質，引起神經源性炎性反應，導致氣道痙攣、血漿滲漏和黏膜水腫等[1]，從而引起氣道和肺組織損傷。P物質是NANC神經纖維末梢釋放的一種主要的速激肽類神經源性炎性介質，與急性胰腺炎和敗血癥等所致的急性肺損傷密切相關[7-8]。有研究[4-6]顯示，新型氣體介質硫化氫在急性胰腺炎、燒傷和敗血癥等相關的肺損傷中起著重要作用。因此，本研究從神經源性炎性反應的角度，探討了硫化氫對神經源性炎性介質P物質的影響及其與肺損傷的關系。此外，本研究分別應用藥物CP-96345、辣椒素和capsazepine阻斷P物質信號通路以及應用PPTA-/-小鼠，觀察硫化氫能否繼續誘發肺組織炎性反應，從而進一步明確硫化氫與P物質釋放的關系。

本研究發現，小鼠腹腔注射外源性硫化氫供體NaHS后血漿P物質濃度明顯升高，同時，肺組織的中性粒細胞浸潤程度(以肺組織MPO活性反映)和肺組織細胞因子水平(以TNF-α和IL-1β水平反映)也顯著升高，肺組織出現充血水腫、炎性細胞浸潤和結構損傷。這一結果提示，NaHS可以刺激氣道NANC神經纖維末梢釋放P物質，促進中性粒細胞浸潤，收縮氣道平滑肌，增加肺血管通透性，最終導致肺損傷。另一方面，本研究通過3種方法預處理阻斷P物質作用通路：(1)腹腔注射CP-96345以阻斷P物質的主要作用受體NK1受體；(2)連續皮下注射辣椒素以耗竭神經末梢P物質；(3)皮下注射capsazepine以選擇性拮抗TRPV1，阻斷神經末梢P物質的釋放。這些預處理均可以顯著抑制硫化氫對肺組織的促炎性反應作用和致損傷作用。此外，本研究還觀察了PPT-A-/-小鼠對NaHS的反應性，結果顯示，NaHS并不能在PPT-A-/-小鼠肺組織中引起明顯的炎性反應和肺損傷，即敲除小鼠編碼P物質的基因后，硫化氫并不能夠引起肺炎性反應，也不能導致肺損傷。這些實驗結果進一步明確了硫化氫誘導肺損傷的機制與促進氣道神經末梢釋放P物質緊密相關。

關于硫化氫與P物質等速激肽類神經源性炎性介質之間的關系，其他學者也有相關研究報道。例如，Trevisani等[9]應用不同濃度的NaHS處理豚鼠離體氣道后，發現氣道P物質的釋放明顯增加，并且NaHS刺激氣道產生了劑量依賴性的收縮反應；然而，用辣椒素耗竭神經纖維中的P物質、阻斷辣椒素特異性TRPV-1受體或阻斷速激肽特異性受體NK1和NK2受體后，NaHS誘導的支氣管收縮反應消失。另外，Patacchini等[10-11]發現，30 μmol/L～3 mmol/L濃度的NaHS可誘發大鼠離體膀胱平滑肌收縮，而用NK1和NK2受體拮抗劑或辣椒素預處理則阻斷了NaHS的這一作用。近期Qgawa等[12]用大鼠足炎模型進行研究發現，硫化氫通過激活瞬時受體電位錨蛋白1通道(transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1)而不是TRPV1，可以升高感覺神經元細胞內游離鈣離子(Ca2+i)濃度，引起疼痛反應尤其是炎性反應狀態下的疼痛反應；而在TRPA1基因敲除小鼠中應用TRPA1受體拮抗劑后，NaHS提高Ca2+i濃度和誘導炎性疼痛的作用明顯減弱。總之，以上這些研究結果均提示，硫化氫可能通過激活辣椒素特異性TRPV-1受體或TRPA1，促進傳入神經纖維末梢的Ca2+內流，從而釋放包括P物質等速激肽類神經源性炎性介質，這些速激肽又通過激活NK1和NK2受體引起炎性細胞趨化和聚集，釋放炎性介質，從而使平滑肌收縮，血管通透性增加，最終引起肺損傷。

此外，Ang等[13-14]在小鼠敗血癥相關肺損傷模型中進一步觀察了硫化氫通過神經源性炎性反應加重肺損傷的具體分子機制。該研究結果顯示，硫化氫通過激活TRPV1，促進肺組織P物質的釋放，進而激活細胞外信號調節激酶1/2(extracellular-signal regulated kinase 1/2，ERK1/2)- 核因子κB(nuclear factor-κB，NF-κB)通路，上調肺組織中環氧合酶2(cyclooxygenase 2，COX-2)的表達和活性，促進前列腺素E(prostaglandin E，PGE)的代謝，進一步加重敗血癥相關的肺組織炎性反應和肺損傷。

綜上所述，本研究主要從神經源性炎性反應的角度觀察了硫化氫誘導肺損傷的可能機制。本研究發現，硫化氫主要通過促進氣道感覺神經末梢釋放P物質，引起肺組織中的中性粒細胞浸潤，釋放TNF-α和IL-1β等細胞因子，導致肺損傷；而阻斷P物質的釋放可以減輕硫化氫誘導的炎性反應以及肺損傷。

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Hydrogen Sulfide Induces the Neurogenic Inflammatory Reaction of Lung Tissues in Mice Mediated by P Substance

ZHAOQianaWANGChangqianaQIAOJian’oubZHANGHuiliaaDepartmentofCardiology,bDepartmentofRespiratoryMedicine,AffiliatedNinthPeople’sHospital,ShanghaiJiaoTongUniversitySchoolofMedicine,Shanghai200011,China

AbstractObjective：To investigate the effect of hydrogen sulfide on the neurogenic inflammation in mouse lung tissues, and its mechanism. Methods:Eight-week old, male Balb/c mice were randomly divided into the following groups: control group, NaHS group, CP-96345 + NaHS group、capsaicin + NaHS group and capsazepine + NaHS group. The mice were pretreated with vehicle, CP-96345 (2.5 mg/kg, i.p.), capsaicin (50 mg/kg, s.c.) or capsazepine (15 mg/kg, s.c.) and then received NaHS (10 mg/kg, i.p.) or 0.9% NaCl solution. One hour after intervention, the mice were sacrificed, then the concentration of substance P in plasma and the levels of tumor necrosis factor-alpha (TNF-α) and interleukine-1 beta (IL-1β) in lung homogenate were measured by ELISA assay. Myeloperoxidase (MPO) activity in lung tissues was detected by tetramethyl benzidine (TMB). The pathological changes of lung tissues were stained with hematoxylin and eosin. On the other hand, the preprotachykinin-A (PPT-A) gene knockout mice (eight-week old, female, PPT-A-/-) and their corresponding wild-type Balb/c mice (eight-week old, female, PPT-A+/+) were randomly given 0.9% NaCl solution or NaHS (10 mg/kg, i.p.). One hour after intervention, the mice were sacrificed, then MPO activity, TNF-α and IL-1β levels in lung tissues as well as the pathological changes of lung tissues were examined. Results: Hydrogen sulfide donor drug NaHS elevated significantly plasma substance P concentration (P<0.05), lung MPO activity as well as lung TNF-α and IL-1β levels (allP<0.05), resulting in lung inflammatory injury. The knockout of PPT-A gene, or pretreatment with CP-96345, capsaicin or capsazepine abolished significantly the elevation of lung MPO activity, lung TNF-α and IL-1β levels, as well as the lung injury induced by NaHS (allP<0.05). Conclusions: Hydrogen sulfide may induce lung inflammatory injury through stimulating the release of substance P in nerve endings.

Key WordsHydrogen sulfide；Inflammation；Substance P；Lung injury

通訊作者張繪莉，E-mail: lilyzhang815@hotmail.com；喬建甌，E-mail：qjou@163.com

基金項目：上海市自然科學基金(編號：13ZR1424200)

中圖分類號R563.1

文獻標識碼A