小鼠生物法與ELISA法檢測麻痹性貝類毒素的比較

杜 偉，王 揚，張曉輝，王鼎南，蔣林娟，封震靜

（浙江省水產質量檢測中心，浙江杭州 310023）

小鼠生物法與ELISA法檢測麻痹性貝類毒素的比較

杜 偉，王 揚?，張曉輝，王鼎南，蔣林娟，封震靜

（浙江省水產質量檢測中心，浙江杭州 310023）

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是全世界分布最廣、危害最大，也是最為大眾熟知的一類赤潮藻毒素。本研究比較了小鼠生物法與酶聯免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）檢測水產品中PSP的效果。結果表明，樣品中PSP含量在350μg·kg－1以上時，2種檢測方法結果吻合度較好；樣品中PSP含量在40～350μg·kg－1時小鼠生物法無法檢測到樣品中PSP，而ELISA法可以快速檢測樣品中PSP；在PSP陰性樣品中兩者檢測結果一致。通過比較研究，2種方法在快速篩選PSP時各有優缺點，日常檢測工作中將2種方法適當結合可提高檢測結果準確度。

麻痹性貝類毒素；小鼠生物法；酶聯免疫吸附法

赤潮（red tides）或有害藻華（harm ful algal blooms）是指在一定環境條件下，海洋生物特別是單細胞藻類迅速增殖或積聚而產生的一種海水變色的自然現象［1］。研究表明，赤潮已經對海洋環境、天然海洋生物資源、近海養殖業、近海旅游業等產生了極大消極作用，其中有毒赤潮藻的影響尤為嚴重。有毒赤潮藻通過食物鏈不僅影響海洋生態系統的結構和功能，而且威脅海洋食品安全。人類食用含有貝類毒素（赤潮藻毒素）的食品時可能中毒，有些貝類毒素甚至有致死風險。與全球赤潮發生趨勢一樣，我國近岸海域赤潮發生頻率一直呈上升態勢，且近些年東海海域有毒赤潮記錄大幅上升［2－3］。海洋有毒赤潮藻及其產生的貝類毒素已經成為當今全球赤潮研究的重要內容。

麻痹性貝類毒素（paralytic shellfish poisoning，PSP）是世界分布最廣、危害最大的一類赤潮藻毒素，它是一類擁有胍基的三環氨基甲酸酯類化合物及其衍生物，由石房蛤毒素（saxitoxin，STX）及其天然衍生物如膝溝藻毒素（gonyantoxins，GTXs）、新石房蛤毒素（neosaxitoxin，neoSTX）組成，由海洋有毒甲藻代謝產生。PSP是一類膜神經性毒素，可以導致中毒者神經麻痹［4］，它有2個滴定點，pKa分別是8.2和11.5，它們之間很容易相互轉化，即毒性低的也可轉化為毒性高的。可產生麻痹性貝類毒素的有毒赤潮藻包括塔瑪亞歷山大藻（Alexandrium tamarense）、巴哈馬麥甲藻扁平變種（Pyrodinium bahamense var．compressum）、鏈狀裸甲藻（Gymnodinium catenatum）等。PSP的基本結構式見圖1［5］。

圖1 PSP的基本結構

目前，常用的PSP檢測方法包括小鼠生物法、高效液相色譜法、薄層色譜法、液相色譜?質譜法、毛細管電泳法、X?射線結晶分析法、核磁共振檢測法、神經受體結合檢測法、免疫學檢測技術、細胞毒性檢測技術等，其中免疫學檢測技術在實踐中常用的為酶聯免疫吸附法（enzyme?linked immunosorbent assay，ELISA）［6］。本文比較了小鼠生物法與ELISA法檢測樣品中PSP含量，旨在為一線檢測人員高效、快速、準確地檢測水產品中PSP含量提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗用縊蟶、釘螺、花蛤、扇貝購自浙江省主要貝類產區水產市場。試驗用小鼠為ICR系雄性小鼠，體重18～20 g；麻痹性貝類毒素檢測試劑盒購自美國ABRAXIS公司；麻痹性貝類毒素標準品（純度99.5%）購自加拿大國家研究委員會。其他分析試劑均為分析純，試驗用水為超純水。

酶標儀，精度為0.1 g的電子天平，機械秒表，均質器，冷凍低速離心機，移液槍，微量多通道加樣器，1 mL注射器，200 m L量筒，電爐，燒杯等。

1.2 樣品處理與制備

用清水徹底洗凈貝類外殼，切斷閉殼肌或小心敲破釘螺外殼，開殼，用清水淋洗內部以去除泥沙及其他外來雜質，仔細取出貝肉，用雙蒸水洗凈取出的貝肉，然后瀝水5 min，撿出碎殼等雜物，將貝肉均質備用。切記不要割破肉體，尤其是腸腺部分要保持完整、不被割破。

縊蟶加標樣品按以下步驟處理：分別取往年實驗室檢測任務中縊蟶PSP陰性樣品3份，每份220 g，分別加入配制好的，含PSP量為132，88和66μg的標準溶液，制成縊蟶加標樣1、縊蟶加標樣2和縊蟶加標樣3。

1.3 小鼠生物測定法

均質樣品中麻痹性貝類毒素提取和小鼠試驗參照SC／T 3023—2004［7］的7.2和7.3部分執行。

1.4 ELISA法

取10 g均質后的貝類樣品或縊蟶加標樣品于干凈燒杯中，加0.1mol·L－1 HCl溶液10mL充分攪拌，檢測pH（pH值為2.0～4.0）。需要時，可逐滴加入5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液調整pH。將混合物煮沸并攪拌5 min，冷卻后將混合液3 500 r·min－1離心10 min，上清用5 mol·L－1 HCl溶液或0.1 mol·L－1 NaOH溶液調節pH值至2.0～4.0。取上清液40μL，用樣品稀釋緩沖液稀釋到1.0 mL，漩渦振蕩1 min；再從上步稀釋的樣品溶液中取50μL用樣品稀釋緩沖液稀釋到2.0 mL，待測。

ELISA檢測步驟按照試劑盒說明書進行。

1.5 定量計算

縊蟶、釘螺、花蛤、扇貝及縊蟶加標樣品小鼠生物法檢測按SC／T 3023—2004計算PSP含量，檢測結果單位為鼠單位MU·kg－1；ELISA法定量計算采用商業化ELISA分析軟件，檢測結果單位為μg·kg－1。根據對東海區PSP檢測毒力系數的經驗值，按照1 MU＝0.2μg將小鼠生物法檢測結果進行換算。

對于平行樣，所有計算取算術平均值。

2 結果與分析

檢測結果見表1。

表1 小鼠生物法與ELISA法檢測結果比較

試驗結果表明，小鼠生物法和ELISA法均可對樣品中的PSP進行檢測。試驗中縊蟶樣品（1～5）、縊蟶樣品加標3（PSP加標量為300μg·kg－1）小鼠生物法檢測結果為陰性，即沒有檢出樣品中含有PSP。相同樣品ELISA法檢測結果分別為13，15，17，16，15和288μg·kg－1，根據1.4節中對樣品前處理的描述，這些樣品上清液的稀釋倍數為2 000倍，按照ELISA檢測試劑盒提供的標準品序列可以確定該稀釋倍數情況下對樣品中PSP的檢出限為4μg·kg－1，則可以確定縊蟶樣品按照ELISA法進行檢測，結果為陰性，而縊蟶樣品加標3的ELISA法檢測結果為288μg·kg－1，加標回收率為96.0%，滿足ELISA法的加標回收率范圍（70%～120%）。

從檢測結果中可以看出，其余樣品按照2種方法檢測，其結果吻合度較好，其中縊蟶樣品加標1（PSP加標量為600μg·kg－1）、縊蟶樣品加標2（PSP加標量為400μg·kg－1）ELISA法的加標回收率分別為89.3%和88.0%，滿足ELISA法的加標回收率范圍。

根據SC／T 3023—2004中關于貝類中麻痹性貝類毒素計算方式的描述，可以確定使用標準體重為20 g的小鼠進行試驗，樣品中PSP檢出限為350μg·kg－1；本試驗中ELISA法按照操作步驟進行推算，在稀釋倍數為2 000倍時，樣品的PSP檢出限為40μg·kg－1，如果將稀釋倍數降低至1 000倍，則PSP的檢出限則只有20μg·kg－1，大大低于小鼠生物法的檢出限，故在檢測縊蟶樣品加標3時本試驗中2種方法的檢測結果出現差異。

綜上所述，樣品中PSP含量在350μg·kg－1以上時，2種檢測方法結果吻合度較好；樣品中PSP含量在350μg·kg－1以下、40μg·kg－1以上時小鼠生物法無法檢測到樣品中PSP，而應用ELISA法可以快速檢測樣品中PSP；本試驗中在PSP陰性樣品中二者檢測結果一致。

3 小結與討論

通過試驗可以看出，在方法檢出限以上范圍內，小鼠生物法與ELISA法檢測結果有較好吻合度，但通常情況下ELISA法檢測結果略小于小鼠生物法，這主要是因為小鼠法是檢測受試樣品中PSP總量，即檢測受試樣品中各種PSP含量的總和，而ELISA法原理是抗原抗體反應，目前研究還局限于單抗，即檢測試劑盒中一般只含有比較單一的抗體。本試驗中采用的ELISA試劑盒，其所含抗體主要針對PSP中的STX，對neo?STX也有一定抗原特異性，故對STX的反應率為100%，對neo?STX的交叉反應率為50%，而對其他組分的PSP交叉反應率較小。

小鼠生物法是檢測PSP的傳統方法，由Sommer的Mayer于1937年創建，目前被美國分析化學家協會確定為PSP標準檢測程序，其優點是操作簡單、能夠檢測受試樣品中PSP總量，缺點是所需樣品量大、重現性差、受客觀影響（主要是小鼠對PSP的敏感度）較大、靈敏度低等，且試驗中需要用到小鼠，出于對動物福利考慮，該方法在有些國家的應用受到限制。

ELISA法屬于新興的PSP檢測方法，其優點是檢出限低、靈敏度高、檢測速度快等，缺點是需要專門儀器設備、未知受試樣品PSP含量情況下很難準確確定樣品稀釋濃度、檢測PSP成分較單一等，且目前市售商品化檢測試劑盒價格相對較高，這些都影響其普遍應用。

將一種檢測方法推向市場，成本會影響其推廣程度。針對本文中2種檢測PSP的方法，小鼠生物法檢測單一樣品費用大約為100元，ELISA法檢測單一樣品費用超過1 000元，主要是因為小鼠生物法能夠根據小鼠死亡時間及體重按照檢測標準提供的換算關系直接計算樣品中PSP含量，而ELISA法每次檢測必須做標準曲線，然后根據受檢樣品在試劑盒微孔上產生的吸光度間接計算樣品中PSP含量。一般商品化試劑盒含有96個微孔及其檢測過程必需標準品、試劑，批量檢測時按照本文操作步驟至少可以檢測超過30個樣品，而如果每次僅檢測一個樣品，則每個檢測試劑盒可檢測樣品量不會超過5個，因此用ELISA法更適合批量檢測，從而降低檢測費用。

日常檢測中，將2種方法適當結合能夠起到互補作用，能夠保證檢測結果的準確性。

［1］ 陸斗定.全球赤潮生態學與海洋學（GEOHAB）國際合作計劃［J］.海洋學研究，2002，20（1）：60－64.

［2］ 陸斗定，Gobel J，王春生，等.浙江海區赤潮生物監測與赤潮實時預測［J］.海洋學研究，2000，18（2）：33－42.

［3］ 舟山市海洋與漁業局.2004年舟山海洋環境公報［EB／OL］.舟山：舟山市海洋與漁業局，2005.http：／／www. zsoaf.gov.cn／files／news05032101.doc.

［4］ Baden D G，Fleming L E，Bean J A.Marine toxins［J］. Handbook of Clinical Neurology，1995，21（65）：75－141.

［5］ Viviani R.Eutrophication，marine biotoxins，human health［J］.Science of the Total Environment，1992（S）：631－662.

［6］ 杜偉，陸斗定.有毒赤潮藻及其毒素的危害與檢測［J］.海洋學研究，2008，26（2）：89－97.

［7］ ST／C 3023—2004麻痹性貝類毒素的測定生物法［S］.

（責任編輯：萬 晶）

S 917.4

A

0528?9017（2015）11?1726?03

文獻著錄格式：杜偉，王揚，張曉輝，等.小鼠生物法與ELISA法檢測麻痹性貝類毒素的比較［J］.浙江農業科學，2015，56（11）：1726－1728.

DOI 10.16178／j.issn.0528?9017.20151109

2015?09?15

杜 偉（1981－），男，山東聊城人，工程師，碩士，主要從事赤潮生物、海洋環境及水產品質量安全等研究工作。E?mail：david?8?0＠163.com。

王 揚（1973－），女，浙江舟山人，教授級高級工程師，碩士，主要從事水產品質量安全等研究工作。E?mail：1752315020＠qq.com。