野甘草醇對(duì)胸腺激酶依賴的更昔洛韋在前列腺癌裸鼠體內(nèi)的增效作用

楊彩云，薛文勇*，齊進(jìn)春，楊　濤，杜　蕾，賈江華(.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000;.河北省人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 05005)

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·論著·

野甘草醇對(duì)胸腺激酶依賴的更昔洛韋在前列腺癌裸鼠體內(nèi)的增效作用

楊彩云1，薛文勇1*，齊進(jìn)春1，楊濤2，杜蕾1，賈江華1(1.河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050000;2.河北省人民醫(yī)院泌尿外科，河北 石家莊 050051)

[摘要]目的觀察野甘草醇(scopadulciol,SDC)在人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶(human telomerase reverse transcriptase,hTERT)啟動(dòng)子調(diào)控腺病毒介導(dǎo)的單純皰疹病毒胸苷激酶基因/更昔洛韋(herpes simplex virus thymidine kinase/ganciclovir,HSV-tk/GCV)自殺基因系統(tǒng)在前列腺癌裸鼠體內(nèi)細(xì)胞自殺作用中的增效作用。方法建立前列腺癌裸鼠移植瘤模型，將不同配伍濃度的SDC、腺病毒-人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子-單純皰疹病毒-胸苷激酶基因(Ad-hTERT-HSV-tk)、GCV應(yīng)用于荷瘤裸鼠，觀察腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量、腫瘤抑制率。結(jié)果A、B、C、D 4組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯小于E、F、G、H組，加入SDC的A、B、C 3個(gè)治療組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯小于未加入SDC的D組(P<0.01)。A、B、C、D 4組腫瘤抑制率明顯小于E、F、G組，加入SDC的A、B、C 腫瘤抑制率明顯小于D組(P<0.01)。結(jié)論通過裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)證實(shí)SDC對(duì)胸腺激酶依賴的GCV阻斷前列腺癌進(jìn)展有一定的增效作用。

[關(guān)鍵詞]前列腺腫瘤；野甘草醇；小鼠

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.009

在人體內(nèi)胸苷激酶 (thymidine kinase,TK)能夠?qū)⒏袈屙f(ganciclovir,GCV)最終代謝為3磷酸GCV，從而能夠殺傷腫瘤細(xì)胞，我們從野甘草分離得到的一種四環(huán)的二萜類化合物野甘草醇(scopadulciol,SDC)能顯著提高TK激酶的活性，3磷酸GCV濃度相應(yīng)增加，從而加強(qiáng)了TK/GCV系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用[1-2]。本研究重組具有腫瘤靶向性的腺病毒-人端粒酶逆轉(zhuǎn)錄酶啟動(dòng)子-單純皰疹病毒胸苷激酶基因(Ad-hTERT-HSV-tk)，同時(shí)將SDC應(yīng)用于Ad-hTERT-HSV-tk/GCV基因系統(tǒng)，通過對(duì)前列腺癌的荷瘤裸鼠模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究，探討 SDC對(duì)TK依賴的GCV在前列腺腫瘤基因治療中增效作用。

1材料與方法

1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與試劑4～6周齡BALB/C裸鼠80只(雌雄各半，體質(zhì)量18～22 g)由中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物培育中心提供。人前列腺癌 LNCaP細(xì)胞株由協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部細(xì)胞中心提供，具有前列腺癌靶向性的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk由我科構(gòu)建，濃度滴度為1×1011pfu/mL，-80 ℃保存，RPMI 1640培養(yǎng)液購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司，GCV購(gòu)于Roche-Syntax公司，SDC由河北醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院藥理學(xué)教研室協(xié)助提取。

1.2模型制備及分組以4×106LNCaP細(xì)胞懸液建立前列腺癌裸鼠(BALAB/C)皮下移植瘤模型，2 d后所有裸鼠左前背部皮下均可見移植瘤形成，5 d后腫瘤直徑長(zhǎng)至4～5 mm。待成瘤約0.5 cm3(腫瘤體積按公式計(jì)算:體積=長(zhǎng)徑×短徑2×π/6) 后，將荷瘤小鼠分為8組，每組10只，共80只。A組:治療1組，腫瘤局部注射1.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；B組:治療2組，腫瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；C組:治療3組，腫瘤局部注射1.0×1010pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；D組：Ad-hTERT-HSV-tk、SDC對(duì)照組，腫瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次，第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d；E組：GCV對(duì)照組，腫瘤局部注射生理鹽水0.1 mL,第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d；F組：GCV、SDC對(duì)照組，腫瘤局部注射生理鹽水0.1 mL,第2～18天腹腔注射GCV 50 mg/d、SDC 1 mg/d；G組:Ad-hTERT-HSV-tk對(duì)照組腫瘤局部注射5.0×109pfu/mL Ad-hTERT-HSV-tk 0.1 mL,第1、7、13天各1次,第2～18天腹腔注射生理鹽水；H組：空白對(duì)照組不給藥。

1.3觀察指標(biāo)各組動(dòng)物從注射腺病毒開始，6周后采用頸椎脫臼法處死，取出腫瘤稱質(zhì)量并進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)。通過直接測(cè)量移植瘤體積、腫瘤質(zhì)量，計(jì)算腫瘤抑制率=(1-治療組瘤質(zhì)量/空白對(duì)照組瘤質(zhì)量)×100%[2]，從宏觀上證明Ad-hTERT-HSV-tk、GCV、SDC的治療作用。

2結(jié)果

實(shí)驗(yàn)開始后，8個(gè)實(shí)驗(yàn)組的腫瘤均呈持續(xù)快速生長(zhǎng)，A、B、C、D4組腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯小于E、F、G、H組，加入SDC的A、B、C3個(gè)治療組 腫瘤體積和腫瘤質(zhì)量均明顯小于未加入SDC的D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。A、B、C、D4組腫瘤抑制率明顯小于E、F、G組，加入SDC的A、B、C腫瘤抑制率明顯小于D組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1各組裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的抑制效應(yīng)

Table1Curativeeffectoftransplanted

tumorofdifferentgroups

組別腫瘤體積(mm3)腫瘤質(zhì)量(g)腫瘤生長(zhǎng)抑制率(%)A組262.73±2.42*#0.71±0.02*#72.96±0.90*#B組243.82±2.74*#0.65±0.02*#75.29±0.75*#C組232.85±1.92*#0.62±0.02*#76.24±0.75*#D組312.06±3.80*0.84±0.02*68.06±0.90*E組950.15±8.212.46±0.026.50±1.13F組967.15±6.772.55±0.023.03±1.49G組947.30±15.722.45±0.036.84±1.01H組976.26±10.632.63±0.02- F21951.19019341.93815233.919P0.0000.0000.000

*P<0.01與E、F、G、H組比較#P<0.01與D組比較(q檢驗(yàn))

3討論

前期實(shí)驗(yàn)重建了具有腫瘤特異性的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk，并通過細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及裸鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk結(jié)合藥物前體GCV能夠靶向性殺傷人前列腺癌以及膀胱癌細(xì)胞，顯著減緩或縮小人前列腺癌以及膀胱癌荷瘤裸鼠的腫瘤體積[3-5]。

重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk的靶向性體現(xiàn)在應(yīng)用于前列腺癌后，HSV-tk基因僅在腫瘤細(xì)胞表達(dá)，靶向性殺傷腫瘤細(xì)胞，而在正常細(xì)胞中檢測(cè)不到HSV-tk基因表達(dá)，GCV的活化產(chǎn)物3磷酸GCV能夠精準(zhǔn)殺傷腫瘤細(xì)胞，人體正常組織幾乎不受影響[6-7]。朱艷培等[8]將HSV-tk/GCV基因系統(tǒng)成功應(yīng)用于人肝癌細(xì)胞治療，并進(jìn)一步研究了其作用機(jī)制。國(guó)內(nèi)外學(xué)者考慮通過增加旁殺傷效應(yīng)來提高基因治療的效果，這樣不僅能夠彌補(bǔ)重組腺病毒轉(zhuǎn)染腫瘤細(xì)胞效率低的不足，更重要的是還能保證治療基因Ad-hTERT-HSV-tk和GCV的安全注射劑量，增加療效的同時(shí)又提高了治療系統(tǒng)的安全性[9-13]。有學(xué)者通過研究發(fā)現(xiàn)SDC能顯著提高TK的活性，從而加強(qiáng)了TK/GCV系統(tǒng)對(duì)腫瘤的殺傷作用[1-2，14]。那么，藥物前體GCV與提高其3磷酸代謝產(chǎn)物水平的TK酶活化劑SDC的聯(lián)合應(yīng)用，能否提高對(duì)腫瘤細(xì)胞的殺傷效應(yīng)，該問題的解決將有助于腫瘤的基因治療。

本研究將Ad-hTERT-HSV-tk/GCV/SDC基因治療系統(tǒng)應(yīng)用于前列腺癌，結(jié)果顯示SDC對(duì) Ad-hTERT-HSV-tk聯(lián)合GCV治療人前列腺癌裸鼠移植瘤的生長(zhǎng)抑制有明顯增強(qiáng)作用；4個(gè)治療組的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量均明顯低于其他幾個(gè)對(duì)照組，并且加入SDC的治療組的腫瘤體積、腫瘤質(zhì)量均明顯低于不加SDC的D組；4個(gè)治療組的腫瘤生長(zhǎng)抑制率均明顯高于其他組，并且加入SDC的治療組明顯高于不加SDC的D組。表明Ad-hTERT-HSV-tk/GCV對(duì)裸鼠前列腺癌移植瘤有明顯的治療作用，加入SDC后可以顯著增加該系統(tǒng)對(duì)前列腺癌的抑制作用。

綜上所述，在裸鼠體內(nèi)SDC對(duì)TK依賴的GCV阻斷前列腺癌進(jìn)展有一定的增效作用，將天然藥物SDC與具有腫瘤靶向性的重組腺病毒Ad-hTERT-HSV-tk以及藥物前體GCV聯(lián)合應(yīng)用可達(dá)到增效減毒的目的，并為開發(fā)治療晚期特別是伴有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前列腺癌的生物藥物奠定了基礎(chǔ)。

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(本文編輯：趙麗潔)

Synergistic effect of scopadulciol in treatment of human prostate cancer in vitro by thymidine kinase-dependent ganciclovir

YANG Cai-yun1,XUE Wen-yong1*,QI Jin-chun1,YANG Tao2,DU Lei1,JIA Jiang-hua1

(1.Department of Urology,the Second Hospital of Hebei Medical University,Shijiazhuang 050000,China;2.Department of Urology,the People's Hospital of Hebei Province,Shijiazhuang 05005,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the synergistic effect of scopadulciol(SDC) on the killing effect on antitumor actions by Ad-hTERT-HSV-tk/GCV suicide gene system on prostate cancer cells in vitro.MethodsWe successfully built the model of human prostate cancer xenografts in BALB/C nude mouse.The BALB/C nude mice were treated respectively with Ad-hTERT-HSV-tk or GCV in combination with SDC in different doses and different concentrations.The indexes of tumor volume,tumor mass,relative tumor curative effect were evaluated.ResultsThe growth rate of tumor volume of four treatment groups could be significantly inhibited after treatment.The tumor volume and tumor mass of group A,group B,group C and group D were significantly lower than the other groups(P<0.01).The relative tumor curative effect of group A,group B,and group C,which were added SDC,were significantly higher than that of group D(P<0.01).ConclusionThe synergistic effect of SDC was significantly shown in treatment of human prostate cancer cells by TK-dependent GCV.

[Key words]prostatic neoplasms;scopadulciol；mice

[中圖分類號(hào)]R737.25

[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A

[文章編號(hào)]1007-3205(2015)12-1397-03

[作者簡(jiǎn)介]楊彩云(1974-)，女，河北元氏人，河北醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院主管護(hù)師，醫(yī)學(xué)學(xué)士，從事臨床護(hù)理學(xué)研究。*通訊作者。E-mail:qjcbaby333@163.com

[基金項(xiàng)目]河北省自然基金資助項(xiàng)目(H2014206047)

[收稿日期]2015-08-17；[修回日期]2015-10-12