MTAD/Nisin抗菌肽聯合應用對根管內糞腸球菌殺菌作用的實驗研究

何薇薇，安　峰*，喬海霞，王曉明，林維龍(.河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000；.河北北方學院檢驗系，河北 張家口 075000)

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·論著·

MTAD/Nisin抗菌肽聯合應用對根管內糞腸球菌殺菌作用的實驗研究

何薇薇1，安峰1*，喬海霞2，王曉明1，林維龍1(1.河北北方學院附屬第一醫院口腔科，河北 張家口 075000；2.河北北方學院檢驗系，河北 張家口 075000)

[摘要]目的觀察MTAD聯合Nisin抗菌肽等沖洗劑對根管內糞腸球菌的抗菌效果。方法在50顆離體牙上建立糞腸球菌根管內感染模型,培養21 d。分為A、B、C 3個實驗組和2個對照組，實驗組分別用MTAD/Nisin抗菌肽、5.25%次氯酸鈉/17%EDTA、復方氯己定含漱液沖洗。在沖洗前、后分別用吸潮紙尖插入根管內進行細菌取樣并培養計數。所有實驗樣本分別浸泡在各自沖洗液中5 min，用慢鉆磨取樣本的牙本質碎屑置于BHI瓊脂板上培養48 h，記錄感染糞腸球菌的樣本數量。結果沖洗前各組根管內細菌數量比較差異無統計學意義(P>0.05)。沖洗后，A、B、C組根管內細菌數量均低于陽性對照組，A組低于B、C組，B組低于C組(P<0.05)。A組感染樣本數低于陽性對照組、B組和C組(P<0.05)。結論MTAD聯合Nisin較5.25%次氯酸鈉/17%EDTA和復方氯已定含漱液對糞腸球菌有更優越的抗菌性能。

[關鍵詞]根管制備；糞腸球菌；根管沖洗劑

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.011

研究顯示細菌對牙髓及根尖周疾病的發展有至關重要的影響[1]。現代根管清理術使根管系統中的許多區域不能直接被器械預備[2]。因此，尋找一種能清除根管內細菌且具有持續殺菌效果的根管沖洗液是非常必要的。理想的根管沖洗劑需要具備以下條件[3]:①有廣泛的抗菌譜；②對厭氧菌和以生物膜形式存在的兼性厭氧菌有高功效；③能溶解壞死的剩余牙髓組織；④能阻止內毒素的活動；⑤能防止在機械預備中玷污層的形成或者可溶解玷污層；⑥當接觸到根尖周組織和牙周組織無毒，極少發生過敏反應。多種不同濃度的次氯酸鈉被用作根管沖洗劑,而5.25%次氯酸鈉/17%乙二胺四乙酸(ethylenediamine tetraacetic acid，EDTA)更在臨床上聯合使用，具有很好的抗菌效果。本研究采用新型沖洗劑MTAD聯合Nisin對感染糞腸球菌的離體牙進行沖洗，同時用5.25%次氯酸鈉/17%EDTA和復方氯己定含漱液行常規對照，以期為臨床上尋找既能有效對抗糞腸球菌又具有多種優良性能的沖洗劑。報告如下。

1材料與方法

1.1實驗標本選取在河北北方學院附屬第一醫院口腔門診新鮮拔除的單根管牙50顆，去除根周軟組織、牙石等，清洗干凈后置于生理鹽水中4 ℃冰箱保存備用，以避免脫水。排除標準：①牙根不完整；②牙根表面存在細小裂紋；③根尖孔未發育；④有齲壞。

1.2實驗用沖洗劑配制Nisin沖洗液：稱取1.5 g Nisin粉，溶于50 mL蒸餾水中，置于-20 ℃保存備用。MTAD沖洗液：MTAD液與蒸餾水按照1∶4比例稀釋后，置于4 ℃保存備用。

1.3制備標準菌液在超凈工作臺上，將糞腸球菌冰凍液復蘇，用移液器取50 μL菌液接種于滅菌的新鮮配制的腦心浸液肉湯(brain heart infusion broth，BHI)培養基中，5% CO2培養箱(37 ℃)培養2 d。采用革蘭染色，經顯微鏡觀察在培養基內糞腸球菌可形成乳脂狀的白色菌落。最后用比渾儀將接種了糞腸球菌的BHI調整成濁度為0.5 mol/L的標準菌液。

1.4建立根管感染模型用無菌砂片將實驗牙切除牙冠，保留12 mm牙根長度。常規消毒拔髓。預備時采用冠向下法并用機動Protaper器械進行，預備到25號(08錐度),根管預備過程中每更換1次器械，用裝有5 mL 0.9% NaCl溶液的注射器配23G側向開口針頭沖洗1 min。預備完成后，用3M樹脂封閉根尖部分。然后將所有離體牙放入含有5 mL BHI試管中,121 ℃高溫高壓下滅菌20 min以達到無菌。隨后將其中40顆離體牙分別浸泡在包含糞腸球菌混濁度為1×108CFU/L 的10 mL BHI中，30 min內操作完畢。37 ℃兼性厭氧條件下培養21 d。讓糞腸球菌侵入牙本質小管。培養基液每3 d更換1次保持細菌水平。從40顆離體牙中隨機抽取10顆用無菌吸潮紙尖從根管內部取樣，然后接種于BHI血瓊脂平皿上，以證實感染。體外根管感染模型建立成功。

1.5實驗分組陰性對照組10顆離體牙不感染細菌。經過3周培養的體外根管感染模型40顆牙，分為陽性對照組和A、B、C 3個實驗組。沖洗方案見表1。

表1　沖洗方案

1.6沖洗及細菌培養所有過程均采用無菌操作，使用無菌手套、鑷子、K銼、吸潮紙尖等。

1.6.1第1次取樣(N1)沖洗前用25號無菌吸潮紙尖按照記錄的工作長度插入根管內停留1 min，吸取根管內液后，立即放入裝有100 μL生理鹽水的Eppendorf管中混勻，10倍系列稀釋，分別接種于BHI血瓊脂平皿上，37 ℃下CO2孵育箱中培養，48 h后計數菌落數(CFU/mL)，記為N1。

1.6.2第2次取樣(N2)用手動不銹鋼K銼繼續預備離體牙至40號，每更換1次器械時分別用沖洗液進行根管沖洗。A組先用5 mL Nisin沖洗液后再使用5 mL MTAD沖洗液沖洗；B組先用5 mL 17%EDTA再使用5 mL 5.25%次氯酸鈉沖洗；C組使用10 mL復方氯己定含漱液沖洗。然后所有樣本用2 mL蒸餾水沖洗根管，無菌鑷子夾持30號吸潮紙尖按照記錄的工作長度插入根管內停留1 min，吸取根管內液，放入裝有100 μL生理鹽水的Eppendorf管中，10倍系列稀釋，送培養計數，記為N2。

1.6.3細菌培養沖洗完成后，將每組離體牙分別浸泡在各自沖洗液內5 min。然后用無菌慢球鉆磨除離體牙根管內壁的牙本質碎屑，并置于BHI瓊脂板上培養48 h，記錄每組有糞腸球菌存在的樣本數量。

1.7統計學方法應用SPSS 19.0統計軟件處理數據。計量資料比較分別采用F檢驗、q檢驗；計數資料比較采用χ2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

在所有陽性對照組中渾濁度明顯，說明在整個實驗過程中樣本中糞腸球菌的感染一直存在；而在陰性對照組中無1例渾濁，說明在整個操作過程中嚴格執行了無菌操作，無交叉感染。沖洗前各組根管內細菌數量比較差異無統計學意義(P>0.05)。經過沖洗劑的沖洗，A、B、C組根管內細菌數量均低于陽性對照組，A組低于B、C組，B組低于C組，差異有統計學意義(P<0.05)。A組感染糞腸球菌牙數低于陽性對照組、B組和C組，差異有統計學意義(P<0.05)。見表2，3。

表2　各組沖洗前后根管內細菌數量比較

*P<0.05與陽性對照組比較#P<0.05與A組比較△P<0.05與B組比較(q檢驗)

表3　各組沖洗劑浸泡后感染糞腸球菌牙數比較

*P<0.05與陽性對照組比較#P<0.05與A組比較(χ2檢驗)

3討論

有學者認為細菌侵入牙本質小管時并不是一個主動過程,它是隨著液體成分在牙本質小管中的滲入進入牙本質小管的，糞腸球菌的直徑為0.5～1.0 μm，而牙本質小管的直徑為1～4 μm,所以糞腸球菌相對大多數細菌更易進入牙本質小管[4]。在根管治療失敗的病例中糞腸球菌檢出率很高，當外界環境允許時，存在于牙本質小管內的糞腸球菌可移動到根管內使患牙形成再感染。所以本研究在體外建立糞腸球菌離體牙感染模型，進行根管預備，并用沖洗劑沖洗根管，模擬臨床操作過程，以比較不同沖洗劑對糞腸球菌的抗菌作用。

次氯酸鈉在醫學和牙科學應用中具有悠久的歷史，次氯酸鈉的主要優勢是對壞死組織的溶解能力及對大多數微生物的抗菌性能強大，弊端是氣味難聞、高毒性、不能去除玷污層[5]。次氯酸鈉的殺菌能力受pH值、溫度等的影響。EDTA幾乎無抗菌能力，但可通過影響牙本質的無機成分有效去除玷污層，臨床上經常與次氯酸鈉聯合使用沖洗根管[2]。MTAD是由有廣譜抗菌作用的3%多西環素、可去除礦物質的4.25%檸檬酸和0.5%聚山梨醇酯80清潔劑組成的水溶液[6]。Cicek等[7]已證實，MTAD的牙本質脫礦能力較17%EDTA優越，使親水性封閉劑等更有效滲透入牙本質層并形成良好的機械嵌合力。Nisin抗菌肽，又稱為乳球菌肽或乳鏈菌肽，是由乳酸鏈球菌和乳酸乳球菌在代謝過程中合成、分泌的具有很強殺菌作用的天然生物活性抗菌肽。對很多G+菌具有抑菌活性，包括多重耐藥的G+致病菌；在絡合劑聯合作用下對G-菌有一定抑制作用[8]。Tong等[9]發現經過Nisin處理后G+菌中的氨基酸、三磷酸腺苷等快速流失，其抗菌機制可能是通過干擾細菌胞膜結構。氯己定生物相容性好，臨床上多制成含漱液，用于咽峽炎、口腔炎、牙齦炎的輔助治療。氯己定具有廣譜抗菌性，對G+、G-及酵母菌有一定的抑菌效應，雖然它可以吸附在細菌胞漿膜的滲透屏障，使細胞內容物漏出，低濃度時呈抑菌作用，但其對這些細菌的抗菌效果并不顯著[10]。

本研究采用平板計數法進行菌落計數，結果顯示通過常規沖洗，各組沖洗劑均不能完全殺滅根管內的糞腸球菌；但將實驗組樣本在各自沖洗劑浸泡5 min后，MTAD聯合Nisin組10例樣本中無1例感染糞腸球菌，表現出極強的殺滅糞腸球菌的性能；而其他2個實驗組分別有10例、9例樣本感染。Tong等[8]證實，當MTAD中的多西環素和Nisin 聯合應用時，Nisin 對細菌胞膜形成的孔洞可以有利于多西環素分子進入到細菌胞內，更好地發揮抗菌作用。且MTAD液呈酸性，Nisin在酸性環境中具有更好的抗菌性和穩定性[11]。已有研究證實MTAD聯合Nisin抗菌肽對變異鏈球菌、血鏈球菌、黏性放線菌、內氏放線菌等有明顯的抗菌效果[8]。體外研究證實MTAD稀釋200倍仍對糞腸球菌有很高的敏感性，而次氯酸鈉稀釋32倍以上即不具備抗菌作用[12]。Davis等[13]體外試驗顯示2%洗必泰和5.25%次氯酸鈉對糞腸球菌的抗菌性能均低于MTAD。與先前報道的研究相符[12,14-15]。然而，本研究結果與之相反。有學者研究發現MTAD和5.25%次氯酸鈉對感染糞腸球菌的根尖5 mm區域有抗菌性能[15]。這些不同的研究結果使MTAD的抗菌效果存有爭議，雖然可能在某些程度上是因為方法的不同(如選擇微生物的取樣步驟或者沖洗劑配比)造成的誤差；而本研究中雖然通過常規沖洗MTAD聯合Nisin抗菌肽并不能完全殺滅糞腸球菌，但通過延長沖洗劑作用根管的時間后MTAD聯合Nisin對與持續性根管感染有關的糞腸球菌的殺菌作用很顯著。此外，本實驗選取的牙齒為單根管的離體牙，根管系統相對簡單，所以根管沖洗劑對于復雜根管系統的消毒效果還有待研究。盡管MTAD沖洗液已開始在臨床上應用，但其在患者口腔內的抗菌效果還需要進一步的研究證實。MTAD聯合Nisin用于根管沖洗目前還只限于離體牙的研究，這種藥物聯合能否有效地根除根管內的致病菌尚需在臨床中進一步檢測。

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(本文編輯：趙麗潔)

In vitro evaluation of antibacterial activities of MTAD/Nisin against Enterococcus faecalis

HE Wei-wei1,AN Feng1*,QIAO Hai-xia2,WANG Xiao-ming1,LIN Wei-long1

(1.Department of Dentistry,the First Affiliated Hospital of Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China;2.Department of Laboratory,Hebei North University，Zhangjiakou 075000，China)

[Abstract]ObjectiveThe in vitro study was to assess the antimicrobial efficacy of different irrigants such as MTAD/Nisin against E.faecalis in contaminated root canals.MethodsFifty single rooted extracted human teeth were inoculated with E.faecalis and incubated for 21 days.The samples were divided in two control groups and three experimental groups irrigated with MTAD/Nisin; 5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle.The bacteria samples were collected with sterile paper points before and after the instrumentation.After washing,the samples of experimental groups immersed in MTAD/Nisin,5.25% NaClO/17%EDTA and compound chlorhexidine gargle for five minutes.Dentin shavings were taken with slow drilling.Shavings were collected on BHI agar plates and incubated for 48 hours.Then,we recorded number of samples with E. faecalis.ResultsThe bacterial culture counts of different groups before rinsing showed no significant difference in the number of bacteria in the root canal(P>0.05).After washing,A,B and C group were lower than the positive control group；A group was less than B,C group；B group was less than C group(P<0.05).The number of samples infection in A group was lower than positive control group,B group and C group(P<0.05).ConclusionThese findings suggest that MTAD/Nisin possesses superior bactericidal activity compared with 5.25% NaClO/17%EDTA,compound chlorhexidine gargle against E.faecalis.

[Key words]root canal preparation；enterococcus faecalis；root canal irrigants

[中圖分類號]R781.3

[文獻標志碼]A

[文章編號]1007-3205(2015)12-1404-04

[作者簡介]何薇薇(1980-)，女，遼寧本溪人，河北北方學院附*通訊作者。E-mail：kq126@126.com

[基金項目]張家口市科學技術研究與發展指導計劃(1321114D)

[收稿日期]2015-07-08；[修回日期]2015-08-07

屬第一醫院主治醫師，醫學碩士，從事口腔疾病診治研究。