HOXC6通過激活轉化生長因子β信號通路增強腫瘤細胞活性

曹曉瑋，閻錫新，劉姣姣，楊　濤(.河北省石家莊市第一醫院呼吸內科，河北 石家莊 0500；2.河北醫科大學第二醫院呼吸內科，河北 石家莊 050000；.河北省石家莊市第一醫院普外科，河北 石家莊0500)

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·論著·

HOXC6通過激活轉化生長因子β信號通路增強腫瘤細胞活性

曹曉瑋1，閻錫新2*，劉姣姣1，楊濤3(1.河北省石家莊市第一醫院呼吸內科，河北 石家莊 050011；2.河北醫科大學第二醫院呼吸內科，河北 石家莊 050000；3.河北省石家莊市第一醫院普外科，河北 石家莊050011)

[摘要]目的通過轉染腫瘤細胞，探討同源異型盒C6(homeobox C6,HOXC6)在腫瘤進展中的作用機制。方法應用質粒轉染、transwell、免疫熒光及Western blot檢測腫瘤細胞中HOXC6表達對轉化生長因子β(transforming growth factor-β,TGF-β)信號通路及腫瘤細胞活性的影響。結果過表達HOXC6的肝癌細胞Huh-7細胞遷移數明顯高于未轉染HOXC6組(P<0.01)，磷酸化Smad2表達明顯高于未轉染HOXC6組(P<0.01)，而Smad2/3表達明顯少于未轉染HOXC6組(P<0.01)。過表達HOXC6的肝癌細胞Huh-7 Smad2在細胞核中表達強。結論HOXC6過表達可激活TGF-β信號通路，增強腫瘤細胞活性。

[關鍵詞]腫瘤細胞,培養的；基因,同源異型盒；轉化生長因子β

doi:10.3969/j.issn.1007-3205.2015.12.015

惡性腫瘤是目前威脅人類生命健康的主要疾病，其中肺癌、肝癌等惡性腫瘤又是世界上主要的致死癌癥[1-2]。惡性腫瘤目前沒有有效的藥物治療，特別是肺癌、肝癌又易早期轉移，大多數患者不能接受手術治療，包括根治性切除。此外，由于腫瘤的高復發性和轉移性，致使手術療效依然不佳。因此，了解疾病的分子學基礎是惡性腫瘤預防和治療非常可取的新策略。目前已有研究證實，同源異型盒基因(homeobox,HOX)是一個含有至少200個轉錄因子的家族，含有一個高度保守的由61個氨基酸同源結構域纏繞而成的DNA。人類HOX家族由39個成員組成，共分為A、B、C、D 4類，存在于7、17、12、2號染色體上，“形似性”用于描述不同種群中基因的關系，以證明在染色體中存在最大的相同序列也就是相同的基因排列(如HOXA5、HOXB5、HOXC5)。而有13個形似性群體存在，不是說HOX基因簇存在于所有13組里，而是每組包含2～4名成員。HOX家族是發育調控基因，其在組織發育和分化過程中發揮著重要調節作用，在組織復制中起關鍵作用。在多種癌癥包括肺癌、白血病、乳腺癌、結腸癌、腎癌、卵巢癌、前列腺癌[3-9]中發現HOX基因失調。HOX家族成員HOXC6在肺癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌和前列腺癌中異常表達，HOXC6表達水平也與淋巴結轉移相關[10-12]。同時有研究表明，胃癌、食管鱗狀細胞癌患者HOXC6過表達術后有效生存期明顯縮短，并證實HOXC6可作為胃癌及食管鱗狀細胞癌術后效果評估的指標[13]。HOXC6通過調節其生物學目標起作用，如骨形態發生蛋白7(bone morphogenetic protein-7,BMP7)、成纖維細胞生長因子受體2(fibroblast growth factor receptor 2,FGER2)、血小板源性生長因子受體α多肽(platelet derived growth factor receptor,PEGFRA)。它也調節磷脂酰肌醇3-激酶/絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶信號通路。以往研究表明，HOXC6 siRNA敲除誘導細胞凋亡，HOXC6過表達導致細胞增生和凋亡減少。本研究通過干擾肝癌細胞中HOXC6的表達觀察其對腫瘤細胞活性的影響，并揭示HOXC6在腫瘤細胞中的作用途徑，旨在為深入研究腫瘤發生的分子機制提供研究線索，并為臨床腫瘤治療提供一個潛在的靶點。現報告如下。

1材料與方法

1.1實驗材料人肝癌細胞株Huh-7、HepG2購自美國模式菌種收集中心。達爾伯克必需基本培養基(Dulbecco minimum essential medium,DMEM)和胎牛血清購自美國Invitrogen公司，哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1(+)和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚購自美國Invitrogen公司、兔多克隆抗體HOXC6(1∶1 000)購自英國Abcam公司，磷酸化蛋白Smad2(1∶1 000)和Smad2/3(1∶1 000)購自美國Cell signaling公司，紅外線標記的兔抗人二抗購自德國LI-COR公司，Odyssey雙色紅外熒光成像儀購自德國LI-COR公司。

本研究經醫院醫學倫理委員會批準。

1.2肝癌細胞復蘇及培養人肝癌細胞株Huh-7、HepG2從液氮罐中取出，置于恒溫水浴箱中(37 ℃)，使凍存細胞懸液溶解后加入37 ℃溫育的培養基DMEM中。1 000 r/min，離心5 min，棄上清液，常規置于DMEM培養基中(含10%胎牛血清和1%青霉素/鏈霉素)，37 ℃,5% CO2加濕空氣培養。

1.3質粒構建利用HepG2細胞株的總DNA 逆轉錄聚合酶鏈反應得到全長的HOXC6 cDNA。引物序列為：正向5′-GGATCCATGAATTCCTACT-TCACT-3′；反向5′-CTCGAGTCACTCTTTCTG-CTTCT-3′。聚合酶鏈反應產物克隆到哺乳動物細胞表達載體pcDNA3.1(+)的BamH Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位點上。建立HOXC6 siRNAs表達載體。用熒光標記梯度濃度的siRNA轉染至肝癌細胞株Huh-7，轉染后于37 ℃ 5% CO2及飽和濕度的細胞培養箱中培養10 h，更換培養液繼續培養72 h，在800 mg/L G418溶液中篩選HOXC6過表達的Huh-7細胞系。

1.4免疫熒光實驗將細胞置于含4%多聚甲醛的磷酸鹽緩沖液玻璃皿中培養30 min。在室溫下以0.1%的Triton X-100滲透化細胞30 min并以0.5%牛血清白蛋白封堵30 min。用磷酸鹽緩沖液沖洗后，和一抗于4 ℃培養過夜。再次用磷酸鹽緩沖液洗滌，在室溫下和用共軛異硫氰酸熒光素標記的二抗培養1 h，然后用4′,6-二脒基-2-苯基吲哚染色。以OLYMPUS顯微鏡成像，拍攝照片。

1.5Western blot檢測每個樣本加入30 μg裂解液，用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳分離并轉移到聚偏二氟乙烯膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)膜上，隨后培養于兔多克隆抗體HOXC6(1∶1 000)，Smad2(1∶1 000)、Smad2/3(1∶1 000)，4 ℃過夜。二抗孵育：以Tris緩沖液(Tris-buffered saline and tween 20，TBST)洗膜，10 min×3次，然后加入1∶10 000稀釋的紅外線標記的兔抗人二抗，37 ℃孵育1.5～2.0 h。成像：采用德國LI-COR公司Odyssey雙色紅外熒光成像儀成像，分析條帶的OD，計算目的產物條帶OD/β-actin產物條帶OD，作為目的產物的相對含量。

1.6Transwell實驗用Transwell實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力。Matrigel-coated transwell 小室上室中以無血清培養基培養1×105細胞，下室則含完全培養基(10%胎牛血清)。在37 ℃，5% CO2培養24 h后，黏附到膜表層的細胞以棉簽清除，遷移到底部的細胞以70%甲醇固定并用結晶紫染色。對遷移到膜底部的細胞進行倒置顯微鏡拍攝照片和計數。

2結果

2.1HOXC6過表達能夠增強肝癌細胞的侵襲及轉移能力將HOXC6低表達的肝癌細胞系Huh-7 轉染HOXC6，然后應用Transwell實驗檢測肝癌細胞的侵襲能力，結果顯示過表達HOXC6肝癌細胞Huh-7細胞遷移數明顯高于未轉染HOXC6組(P<0.01)，見表 1。

表1　肝癌細胞轉染HOXC6后侵襲能力的變化 　，個)

2.2HOXC6能夠通過激活TGF-β信號通路增強肝癌細胞的侵襲及轉移能力應用Western blot檢測TGF-β信號通路中關鍵蛋白Smad2，結果發現過表達HOXC6肝癌細胞Huh-7中磷酸化Smad2表達明顯高于未轉染HOXC6組(P<0.01)，而Smad2/3表達明顯少于未轉染HOXC6組(P<0.01)，見表2。

應用免疫熒光實驗檢測肝癌細胞Huh-7轉染HOXC6后Smad2在細胞內定位的變化，結果發現過表達HOXC6的肝癌細胞Huh-7與未轉染HOXC6的肝癌細胞Huh-7 相比Smad2在細胞核中表達強 (圖1)。

表2　肝癌細胞轉染HOXC6后Smad2及

圖1肝癌細胞Huh-7轉染HOXC6后Smad2在細胞內定位的變化(免疫熒光 ×100)

3討論

很多分子途徑通過控制胚胎發育過程參與腫瘤形成。HOX轉錄因子在胚胎發育中必不可少，且在細胞關鍵的分化和增殖中起決定性作用。已有報道稱在畸形和惡性腫瘤中HOX基因表達異常，故HOX基因的表達在惡性腫瘤診斷和治療中可能很重要[14]。無論在體內還是體外，HOX過表達都能使哺乳動物的細胞改變，且在許多腫瘤類型中都發現了HOX基因的表達。正常HOX基因的表達被破壞，通過多種途徑促進腫瘤形成和轉移。

不同種類HOX基因失調與人類數種癌癥相關，包括肺癌、肝癌、白血病、大腸癌、乳腺癌、腎癌、黑色素瘤和皮膚鱗狀細胞癌等[3-8]。因為各個基因并不一致，所以考慮HOX不是一個單一的致病基因，而是組織特異性干擾已有的HOX導致其表達失調來致病。在人體內，HOX基因構成數個最大的基因家族，包含一個序列，稱為同源異型盒。同源異型盒首先在果蠅的同源基因中確定。HOX基因是高度保守的，它跨越的范圍很廣，從秀麗隱桿線蟲、果蠅到人類。1992年，建立了脊椎動物的統一命名系統，按規定人類基因用大寫字母(HOXA1)，小鼠基因用小寫字母(Hoxa1)。小鼠基因破壞的研究表明，在發育過程中基因有一定程度的功能性合作，這些研究正在擴展到人體組織。然而，由于旁系關系復雜，個人HOX基因的重要性目前未知。事實上，越來越多證據表明，同樣的HOX基因在不同組織中功能不同，這種蛋白結構的特異性很重要。

HOXC6是HOX家族成員，據猜測它的功能可能是通過位于其N端的DNA同源結構域直接結合到DNA的啟動子元件上。HOXC6在肺癌、卵巢癌、食管癌、乳腺癌和前列腺癌中異常表達，HOXC6表達水平也與淋巴結轉移相關。在前列腺細胞中，HOXC6直接調節 BMP7、FGFR2、胰島素樣生長因子結合蛋白3和PDGFRA的表達，間接影響糖蛋白Wnt信號通路；抑制PDGFRA可以抑制前列腺癌細胞增殖，而它的過表達能夠對抗PDGFRA抑制的影響[9]。HOXC6過表達可導致胃癌、食管鱗狀細胞癌患者術后有效生存期明顯縮短，HOXC6可作為胃癌及食管鱗狀細胞癌患者術后效果評估的指標。HOXC6表達增加有促進癌癥淋巴結轉移的傾向，HOXC6 siRNA敲除誘導細胞凋亡，HOXC6過表達導致細胞增生和凋亡減少。提示HOXC6可能在腫瘤轉移中起重要作用。

TGF-β是一種以二硫鍵鏈接的多肽，在其結構中有9個半胱氨酸殘基通過二硫鍵鏈接組成半胱氨酸的剛性結構，目前已發現TGF-β在哺乳動物中存在TGF-β1、TGF-β2、 TGF-β3共3個亞單位，它們的核苷酸序列具有高度的同源性。其中TGF-β1位于人類第19號染色體上，是一種多效性細胞因子，有助于切口愈合、血管生成、纖維化等。越來越多證據表明，TGF-β1既可以作為腫瘤抑制因子，又能通過SMAD蛋白依賴和非依賴級聯反應促進腫瘤啟動。事實上TGF-β1的功能取決于腫瘤的分期。在正常的上皮細胞，它作為腫瘤抑制因子，抑制細胞增殖和誘導凋亡；反之，當腫瘤已存在時，則加快癌癥進展。TGF-β可以作為任一種腫瘤的抑制因子或啟動子。在腫瘤發生初期TGF-β通過上調細胞周期蛋白激酶抑制劑的水平來抑制腫瘤細胞生長，但隨著惡性腫瘤的進展，細胞周期蛋白激酶抑制劑水平不能抑制腫瘤生長時，腫瘤細胞開始產生大量的TGF-β，這時TGF-β成為腫瘤啟動子并通過Smad蛋白依賴性和非依賴性途徑誘導上皮向間質轉變，從而促進腫瘤的生長和轉移。此外，TGF-β在間質細胞和腫瘤細胞的相互作用中發揮著中介作用，且TGF-β調節腫瘤微環境。目前有研究發現，乳腺癌小鼠模型接受放療或化療后體內TGF-β1表達水平明顯增高并促進了腫瘤細胞的侵襲、轉移，應用抗TGF-β的單克隆抗體處理后乳腺癌小鼠模型中腫瘤的侵襲和轉移明顯得到抑制[15-16]。證實TGF-β1水平高表達可促進腫瘤的進展。

那么HOXC6是否也可以通過TGF-β信號通路參與腫瘤的進展。本研究結果顯示過表達HOXC6肝癌細胞Huh-7細胞遷移數明顯高于未轉染HOXC6肝癌細胞Huh-7，證實肝癌細胞的侵襲能力明顯增強；行Western blot檢測及免疫熒光實驗，結果顯示過表達HOXC6肝癌細胞Huh-7與未轉染HOXC6肝癌細胞Huh-7相比，磷酸化Smad2表達明顯增加，Smad2/3表達則明顯減少，并且Smad2易位于細胞核。證實TGF-β信號通路中的關鍵蛋白Smad2被活化，TGF-β信號通路活性明顯增加。

綜上所述，在肝癌細胞中過表達HOXC6可以通過激活TGF-β信號通路增強其侵襲能力，證實HOXC6可以通過誘導TGF-β信號通路在腫瘤發生發展過程中起著重要作用，這些將有可能為臨床腫瘤的治療提供一個潛在靶點，但TGF-β信號具體通過誘導那些基因發揮其作用，尚需進一步深入研究來確定。

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(本文編輯：趙麗潔)

[中圖分類號]R394.26

[文獻標志碼]B

[文章編號]1007-3205(2015)12-1420-05

[作者簡介]曹曉瑋(1977-)，女，河北邢臺人，河北省石家莊市第一醫院副主任醫師，醫學博士研究生，從事呼吸系統疾病診治研究。*通訊作者。E-mail:xi-xin-yan@163.com

[基金項目]石家莊市科學技術研究與發展指導計劃(141463243)

[收稿日期]2015-11-18；[修回日期]2015-12-04