ROS介導的氧化應激在INH誘導的細胞毒性中的作用及槲皮素的干預

盧春鳳，楊 玉，商 宇，王培軍，陳廷玉，王麗敏，朱秋雙，張井凡

佳木斯大學，佳木斯154007

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ROS介導的氧化應激在INH誘導的細胞毒性中的作用及槲皮素的干預

盧春鳳*，楊 玉，商 宇，王培軍，陳廷玉，王麗敏，朱秋雙，張井凡

佳木斯大學，佳木斯154007

為探討ROS介導的氧化應激在異煙肼(INH)誘導L-02細胞毒性中的作用及槲皮素的干預作用，建立體外培養INH誘導L-02細胞氧化損傷模型，實驗分為對照組(A)、INH組(B)、槲皮素低劑量組(C)及槲皮素高劑量組(D)。采用生化分析法檢測L-02細胞培養液中天冬氨酸氨基轉移酶(AST)和丙氨酸氨基轉移酶(ALT)的活性；利用熒光探針檢測L-02細胞線粒體內活性氧(ROS)水平；應用比色法檢測L-02細胞內丙二醛(MDA)、谷胱甘肽(GSH)的含量以及主要抗氧化物酶的活性。結果表明，與對照組相比，INH能顯著增加L-02細胞培養液中AST和ALT的活性、細胞線粒體內ROS水平及細胞內MDA的含量(P<0.01)，并顯著減少L-02細胞內GSH的含量及超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)的活性(P<0.01)。與INH組比較，槲皮素低劑量組L-02細胞培養液中AST的活性、線粒體內ROS水平及細胞內MDA的含量明顯降低(P<0.05)，而細胞內SOD的活性明顯增加(P<0.05)；高劑量槲皮素能顯著降低L-02細胞培養液中AST和ALT的活性、細胞線粒體內ROS水平及細胞內MDA的含量(P<0.01)，并能顯著增高L-02細胞內GSH的含量和主要抗氧化物酶的活性(P<0.01)。與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組的保護效應更明顯(P<0.05)。可見，ROS介導的氧化應激在INH誘導的L-02細胞毒性中發揮了重要作用，且槲皮素對INH誘導的L-02細胞氧化損傷具有保護作用。

槲皮素；異煙肼；L-02細胞；氧化應激

隨著人們生活水平的提高，醫藥品和個人護理品(pharmaceuticals and personal care products, PPCPs)使用日益頻繁，PPCPs中的醫藥品是廣泛用于人類或動物疾病防治的一大類化學物質，這些醫藥品或因生產企業對廢水處理不當，或因使用中不能被人體或動物完全吸收，致使大一部分以原藥或其代謝產物的形式排入城市污水處理系統乃至地表水環境中，對生態系統和人類健康造成威脅。異煙肼(INH)是世界衛生組織推薦的、不可替代的一線抗結核藥[1]，2014年INH藥品銷售數據市場調研報告顯示，我國INH的銷售量達到5 MG，較2013年增長25%[2]，雖然目前尚未查閱到INH在水體中濃度水平的文獻報道，但大量的生產和使用很可能導致INH排入環境中，對生物體造成潛在危害。有研究表明，INH可引起明顯的氧化應激反應，從而導致細胞損傷[3]，但細胞毒性機制卻尚未闡明[4-5]。槲皮素(quercetin)是植物界分布最廣的黃酮類化合物，廣泛存在于水果、蔬菜以及一些中草藥中，是人類飲食中最主要的生物類黃酮。近年來，隨著人們對槲皮素了解的深入，槲皮素的抗氧化作用已引起國內外學者的高度重視。有研究報道，槲皮素對環境污染物鎘及環境雌激素引起的細胞氧化損傷具有保護作用[6-7]。大量研究表明，槲皮素是強的自由基清除劑[8]，對超氧陰離子有直接或間接的清除作用，進而達到保護細胞免受各種不良因素的損傷，發揮其抗炎、抗纖維化、調節免疫功能、抗腫瘤、抗氧化等作用[9-10]。本實驗以L-02細胞為研究對象，從亞細胞水平上揭示INH的作用靶點，以活性氧(ROS)介導的氧化損傷為切入點，進一步探究INH細胞毒性機制，同時探討槲皮素對INH等環境污染物引起的氧化損傷的保護作用及可能機制。

1 材料和方法(Materials and methods)

1.1 細胞與主要試劑

正常人肝細胞株：L-02購自中國科學院上海細胞生物研究所；DMEM培養基購自Gibco公司；胎牛血清購自Hyclone公司；異煙肼、槲皮素、2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)均購自Sigma公司；2-硫代巴比妥酸(TBA)、谷胱甘肽(GSH)、四乙氧基丙烷均購自Fluka公司；天冬氨酸氨基轉移酶(AST)、丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、超氧化物歧化酶(SOD)及谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)檢測試劑盒均購自南京建成生物工程研究所。

1.2 方法

細胞用含10%胎牛血清的DMEM培養基常規培養，實驗分為4組，對照組(A)：給予等體積的無血清培養基、INH組(B)：給予INH 10 mmol·L-1、槲皮素低劑量組(C)：給予INH 10 mmol·L-1+槲皮素25 μmol·L-1、槲皮素高劑量組(D)：給予INH 10 mmol·L-1+槲皮素50 μmol·L-1。細胞經上述處理24 h后，收集各組細胞培養上清液，按試劑盒說明方法檢測細胞培養液中AST和ALT的活性；收集細胞，用差速離心法分離線粒體，采用熒光探針2,7-二氯熒光素二乙酸酯(DCFH-DA)檢測L-02細胞線粒體內ROS水平；應用TBA及比色法檢測L-02細胞內丙二醛(MDA)和GSH含量；采用黃嘌呤氧化酶法及二硫代二硝基苯甲酸(DTNB)直接法測定L-02細胞內SOD和GSH-Px的活性。

1.3 統計學分析

2 結果(Results)

2.1 L-02細胞培養液中AST和ALT的活性

INH和槲皮素處理L-02細胞后，細胞培養液中AST和ALT的活性見圖1-2。與對照組相比，INH組細胞培養液中AST和ALT的活性均顯著升高(P<0.01)。與INH組相比，低劑量的槲皮素能明顯降低細胞培養液中AST的活性(P<0.05)，而高劑量槲皮素能顯著降低細胞培養液中AST和ALT的活性(P<0.01)。與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組細胞培養液中AST和ALT活性降低的更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.2 L-02細胞線粒體內ROS的水平

INH和槲皮素處理L-02細胞后，細胞線粒體內ROS的水平見圖3。與對照組相比，INH組細胞的熒光強度明顯增強，利用軟件進行熒光強度分析結果表明，細胞線粒體內ROS水平顯著增高(P<0.01)。與INH組相比，槲皮素低劑量組細胞線粒體內ROS的水平明顯降低(P<0.05)，而槲皮素高劑量組細胞線粒體內ROS的水平顯著降低(P<0.01)。與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組細胞線粒體內ROS水平降低的更明顯(P<0.05)。

2.3 L-02細胞內MDA和GSH的含量

INH和槲皮素處理L-02細胞后，細胞內MDA和GSH的含量見圖4-5。與對照組相比，INH組細胞內MDA的含量顯著升高(P<0.01)，而細胞內GSH的含量顯著降低(P<0.01)。與INH組相比，低劑量的槲皮素能明顯降低細胞MDA的含量(P<0.05)。而高劑量槲皮素能顯著降低細胞內MDA的含量(P<0.01)，并顯著增加細胞內GSH的水平(P<0.01)。與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組細胞內MDA含量降低與GSH水平增加的更明顯，差異有統計學意義(P<0.05)。

2.4 L-02細胞內SOD和GSH-Px的活性

INH和槲皮素處理L-02細胞后，細胞內SOD和GSH-Px的活性見圖6-7。與對照組比較，INH組細胞內SOD和GSH-Px活性顯著降低(P<0.01)。與INH組比較，槲皮素低劑量組細胞內SOD活性明顯增高(P<0.05)，而細胞內GSH-Px活性有所增高，但差異無統計學意義(P>0.05)。槲皮素高劑量組細胞內GSH-Px和SOD活性明顯增高(P<0.05或P<0.01)；與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組細胞內SOD和GSH-Px活性增高的更明顯(P<0.05)。

圖1 L-02細胞培養液中天冬氨酸氨基轉移酶的活性(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05，##P<0.01；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 1 The activity of AST in L-02 cell supernatant(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group;D: Quercetin high dose group.*P<0.05,**P<0.01, compared withcontrol group;#P<0.05,##P<0.01, compared with INH group;▲P<0.05, compared with Quercetin low dose group)

圖2 L-02細胞培養液中丙氨酸氨基轉移酶的活性(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，##P<0.01；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 2 The activity of ALT in L-02 cell supernatant(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group;D: Quercetin high dose group.*P<0.05,**P<0.01, compared withcontrol group;##P<0.01, compared with INH group;▲P<0.05,compared with Quercetin low dose group)

圖3 L-02細胞線粒體內活性氧的水平(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05，##P<0.01；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 3 The level of mitochondrial ROS in L-02 cell(A:control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group; D: Quercetin high dose group. *P<0.05, **P<0.01, compared with control group;#P<0.05,##P<0.01, compared with INH group;▲P<0.05, compared with Quercetin low dose group)

圖4 L-02細胞內丙二醛的含量(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05，##P<0.01；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 4 The content of MDA in L-02 cells(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group; D: Quercetin high dose group. *P<0.05, **P<0.01, compared with control group;#P<0.05,##P<0.01, compared with INH group;▲P<0.05, compared with Quercetin low dose group)

圖5 L-02細胞內谷胱甘肽的含量(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 5 The content of GSH in L-02 cells(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group;D: Quercetin high dose group.*P<0.05,**P<0.01, compared with control group;#P<0.05, compared with INH group;▲P<0.05,compared with Quercetin low dose group)

圖6 L-02細胞超氧化物歧化酶的活性(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05；##P<0.01；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 6 The activity of SOD in L-02 cells(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group;D: Quercetin high dose group.*P<0.05,**P<0.01, compared with control group;#P<0.05,##P<0.01, compared with INH group;▲P<0.05, compared with Quercetin low dose group)

圖7 L-02細胞谷胱甘肽過氧化物酶的活性(A：對照組；B：INH組；C：槲皮素低劑量組；D：槲皮素高劑量組。與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01；與INH組相比，#P<0.05；與槲皮素低劑量組相比，▲P<0.05)Fig. 7 The activity of GSH-Px in L-02 cells(A: control group; B: INH group; C: Quercetin low dose group; D: Quercetin high dose group.*P<0.05,**P<0.01, compared with control group;#P<0.05, compared with INH group;▲P<0.05, compared with Quercetin low dose group)

3 討論(Discussion)

研究表明，氧化應激是許多醫藥品等環境污染物引起細胞毒性的主要機制，而線粒體是細胞ROS產生的主要場所，也是氧化損傷的主要靶細胞器，在多種化合物引起的細胞毒性中發揮了重要作用[11-15]。因此，本實驗以人肝細胞L-02為研究對象，從氧化損傷角度研究INH細胞毒性，重點探討槲皮素對INH所致細胞氧化損傷的保護作用及可能機制。本實驗發現，L-02細胞用INH處理后，細胞培養液中AST和ALT的活性顯著增高，因AST和ALT是公認的反映肝細胞損傷的最敏感指標，結果表明INH引起了肝細胞損傷。那么INH導致的肝細胞損傷是否與ROS介導的氧化應激有關？正常情況下，細胞內氧自由基的產生與清除處于動態平衡狀態，當細胞內ROS等自由基生成增加或抗氧化系統的清除能力降低，細胞將會發生氧化應激反應，引起細胞內大分子物質發生氧化損傷，從而造成細胞損傷。ROS是細胞內主要的氧自由基[16]，它的水平能反映細胞內氧化系統的情況；MDA是典型的脂質過氧化產物，其含量的多少可反映細胞發生脂質過氧化的程度，間接反映細胞發生氧化損傷的情況；而GSH、SOD和GSH-Px是細胞內重要的抗氧化物和抗氧化酶，它們的含量和活性可間接反映細胞的抗氧化能力。因此，我們進一步檢測了L-02細胞線粒體內ROS水平、細胞內MDA、GSH含量及SOD和GSH-Px的活性。結果發現，L-02細胞經INH處理后，線粒體內ROS水平和細胞中MDA的含量顯著升高，而細胞內GSH的含量、SOD和GSH-Px的活性顯著降低，表明在本實驗條件下INH可誘導肝細胞發生氧化損傷。提示INH能促進線粒體ROS產生，降低細胞GSH含量、SOD和GSH-Px的活性，誘導細胞產生氧化應激反應，使MDA含量增高，造成細胞損傷[17-18]。

本實驗還發現，與INH組比較，低劑量槲皮素能明顯降低L-02細胞培養液中AST的活性，而高劑量槲皮素能顯著降低L-02細胞培養液中AST和ALT的活性，表明槲皮素對肝細胞氧化損傷具有保護作用，且槲皮素高劑量組的保護效應比槲皮素低劑量組更顯著。有研究報道，槲皮素對環境污染物鎘及環境雌激素引起的細胞氧化損傷也具有保護作用。吳紅赤等[1]對鎘致大鼠急性腎損傷及槲皮素對腎損傷的保護作用進行了研究，實驗證明槲皮素對鎘致急性腎損傷具有保護作用。鎘可通過多種途徑破壞體內自由基平衡和抗氧化系統的功能，導致機體氧化損傷。大量研究表明，在體外槲皮素可通過清除氧自由基、抑制脂質氧化損傷、與金屬離子螯合等發揮抗氧化作用[19-20]。此外，體內實驗證實槲皮素可通過降低脂質過氧化物水平、增加抗氧化物含量及提高抗氧化酶活性對氧化損傷發揮保護作用[21]。另外，李桂玲等[7]研究了槲皮素對環境雌激素己烯雌酚誘導的體外培養倉鼠睪丸生精細胞氧化損傷的保護作用，結果表明，槲皮素可有效對抗自由基，抑制脂質過氧化，減弱己烯雌酚導致的生精細胞損傷，提示槲皮素對環境雌激素誘導的氧化應激導致的生殖毒性具體保護作用。以上實驗研究證明，槲皮素能夠增強抗氧化酶的活性，降低脂質過氧化產物的生成，從而減輕細胞氧化損傷。與本實驗結果相似，本研究表明低劑量槲皮素能明顯降低L-02細胞線粒體內ROS的水平及細胞內MDA的含量，增加細胞內SOD的活性；而高劑量槲皮素能顯著降低L-02細胞線粒體內ROS的水平及細胞內MDA的含量，并顯著增高細胞內GSH的含量和主要抗氧化物酶的活性。與槲皮素低劑量組相比，槲皮素高劑量組的保護效應更明顯。提示槲皮素對INH誘導的肝細胞氧化損傷的保護作用可能與其能減少細胞線粒體ROS生成，增加抗氧化物GSH的含量及抗氧化酶SOD和GSH-Px的活性有關。

綜上所述，在本實驗條件下，INH可誘導L-02細胞發生氧化損傷，其機制可能是INH進入細胞內減少抗氧化物的含量及抗氧化酶的活性，導致細胞線粒體ROS生成增多，使細胞內氧化系統與抗氧化系統失衡，而造成細胞氧化損傷。可見，ROS介導的氧化應激在INH誘導的肝細胞毒性中發揮了重要作用。槲皮素對INH誘導的細胞氧化損傷具有保護作用，其機制可能與槲皮素減少細胞ROS生成，增加細胞抗氧化系統的能力，發揮抗脂質過氧化作用有關。但是否還有其他機制參與，尚有待于進一步深入研究。

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◆

The Role of ROS-mediated Oxidative Stress in INH-induced Cytotoxicity and the Intervention of Quercetin

Lu Chunfeng*, Yang Yu, Shang Yu, Wang Peijun, Chen Tingyu, Wang Limin, Zhu Qiushuang, Zhang Jingfan

Jiamusi University, Jiamusi 154007, China

Received 20 October 2014 accepted 29 December 2014

In order to investigate the role of ROS-mediated oxidative stress in INH-induced L-02 cytotoxicity and the intervention of Quercetin, the injury model of hepatocyte L-02 in vitro induced by INH was established. The cells were assigned into the control group (A), INH group (B), Quercetin low dose group (C) and Quercetin high dose group (D). The activity of aspartate aminotransferase (AST) and the activity of alanine transaminase (ALT) in L-02 cells supernatant were determined by biochemical methods; The level of mitochondrial reactive oxygen species (ROS) was measured by fluorescent probe 2,7-dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH-DA) in L-02 cells; The content of malondialdehyde (MDA), the content of glutathione (GSH) and the activity of antioxidant enzymes were analyzed with colorimetric method. The results showed that compared with the control group, INH remarkably increased the activity of AST and the activity of ALT in L-02 cells supernatant, the level of mitochondrial ROS and the content of MDA in L-02 cells (P<0.01), and significantly decreased the content of GSH and the activity of superoxide dismutase (SOD), the activity of glutathione peroxidase (GSH-Px) (P<0.01). Compared with the INH group, the activity of AST in L-02 cells supernatant, the level of ROS in mitochondria and the content of MDA in L-02 cells of Quercetin low dose group were decreased (P<0.05), but the activity of SOD was increased (P<0.05); While high dose Quercetin could significantly reduce the activity of AST and the activity of ALT in L-02 cells supernatant, the level of mitochondrial ROS and the content of MDA in L-02 cells (P<0.01), and significantly increased the content of GSH, the activity of SOD and the activity of GSH-Px (P<0.01). Compared with the Quercetin low dose group, the protective effects of high dose Quercetin were more obvious (P<0.05). Therefore, ROS-mediated oxidative stress plays an important role in INH-induced L-02 cell toxicity, and Quercetin has a protective effect on L-02 cell oxidative damage induced by INH.

quercetin; isoniazid; L-02 cell; oxidative stress

國家自然科學基金資助項目(81373497)；黑龍江省自然科學基金資助項目(D201248)；佳木斯大學科學技術研究項目(Sjz2012-09)

盧春鳳(1969-)，女，博士，教授，研究方向為毒理學，E-mail: luchunfengchen@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: luchunfengchen@163.com

10.7524/AJE.1673-5897-20141020003

2014-10-20 錄用日期：2014-12-29

1673-5897(2015)3-209-07

R965；R332；R285

A

盧春鳳(1969-)，女，博士，教授，博士生導師；主要研究方向為毒理學，發表學術論文50余篇。

盧春鳳, 楊玉, 商宇, 等. ROS介導的氧化應激在INH誘導的細胞毒性中的作用及槲皮素的干預[J]. 生態毒理學報, 2015, 10(3): 209-215

Lu C F, Yang Y, Shang Y, et al. The role of ROS-mediated oxidative stress in INH-induced cytotoxicity and the intervention of quercetin [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 209-215 (in Chinese)