杜佳，王樹濤， 劉 征，尤宏,2,*

1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)，水資源與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090 2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)，海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，威海 264209

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全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)單獨(dú)與聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響

杜佳1，王樹濤1， 劉 征1，尤宏1,2,*

1. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)，水資源與環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，哈爾濱150090 2. 哈爾濱工業(yè)大學(xué)(威海)，海洋科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，威海 264209

探討全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)復(fù)合暴露對(duì)斑馬魚機(jī)體氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響。將斑馬魚胚胎暴露于PFOS(0、0.4、0.8和1.6 mg·L-1)、Nano-ZnO (0、12.5、25和50 mg·L-1)、PFOS+Nano-ZnO (0、0.4+12.5、0.8+25和1.6+50 mg·L-1)溶液中6天后，檢測相關(guān)的酶活性變化(超氧化物歧化酶(SOD)、過氧化氫酶(CAT)、谷胱甘肽過氧化物酶(Gpx)、脂質(zhì)過氧化物(MDA)、半胱氨酸蛋白酶(Caspase-3和Caspase-9)和與細(xì)胞凋亡相關(guān)基因(Bax, p53和Bcl-2)表達(dá)情況。結(jié)果表明：PFOS和Nano-ZnO單獨(dú)與復(fù)合暴露均可造成斑馬魚胚胎的氧化損傷和細(xì)胞凋亡，但復(fù)合暴露組的氧化損傷和細(xì)胞凋亡程度明顯大于單獨(dú)暴露組。在PFOS和Nano-ZnO單獨(dú)和復(fù)合暴露組中，隨著處理濃度的升高，SOD、Gpx、Caspase-3和Caspase-9酶的活性顯著升高。而CAT酶活性隨著處理濃度的升高抑制作用顯著。PFOS與Nano-ZnO復(fù)合暴露組與單獨(dú)暴露組相比，Bax和p53表達(dá)顯著上調(diào)，而Bcl-2表達(dá)顯著下調(diào)。因此，在實(shí)驗(yàn)濃度范圍內(nèi)，等毒性配比1:1條件下，推測Nano-ZnO可以增強(qiáng)PFOS對(duì)斑馬魚胚胎的氧化損傷和細(xì)胞凋亡毒性。

全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)；納米氧化鋅(Nano-ZnO)；氧化應(yīng)激；細(xì)胞凋亡；聯(lián)合毒性

納米材料(nanomaterials, NM)是指三維空間中至少有一維處于納米尺度范圍(1～100nm)或由它們作為基本單元構(gòu)成的材料，其廣泛應(yīng)用于工業(yè)、醫(yī)藥和生活各個(gè)領(lǐng)域[1]。NMs在生產(chǎn)、使用及處理過程中不可避免地會(huì)以納米顆粒(nanoparticles, NPs)污染物的形式進(jìn)入環(huán)境。由于NPs尺寸微小、比表面積巨大，比常規(guī)尺寸材料具有更大的表面活性和遷移能力，很容易被生物組織吸收而產(chǎn)生毒性效應(yīng)。目前，NPs已成為一類普遍關(guān)注的新型污染物。

納米氧化鋅(Nano-ZnO)廣泛應(yīng)用于電子產(chǎn)品、染料、催化劑及化妝品等多個(gè)領(lǐng)域，其在使用和處理過程中會(huì)不可避免的進(jìn)入環(huán)境。目前，在河流、土壤等環(huán)境樣品中都檢測到了Nano-ZnO[2-3]。Nano-ZnO的潛在生物毒性引起了人們的廣泛關(guān)注。Gojova等[4]發(fā)現(xiàn)Nano-ZnO能夠誘導(dǎo)血管內(nèi)皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)。Nano-ZnO能誘導(dǎo)人類肝細(xì)胞產(chǎn)生凋亡現(xiàn)象[5]，并引起鯽魚肝臟的氧化損傷[6]。Canas等[7]發(fā)現(xiàn)長期暴露在Nano-ZnO的土壤中能夠?qū)︱球镜纳钞a(chǎn)生影響。Nano-ZnO的長期暴露能夠影響淡水蝸的氧化應(yīng)激反應(yīng)并能誘導(dǎo)基因毒性[8]。雖然Nano-ZnO的毒性研究已取得了一定的進(jìn)展，但Nano-ZnO對(duì)生物的毒性效應(yīng)以及毒性作用的分子學(xué)機(jī)理依然是目前環(huán)境毒理學(xué)領(lǐng)域亟待解決的問題。

全氟辛烷磺酸鉀(perfluorooctanesul phonic acid potassium salt , PFOS)是一種人造全氟化合物，廣泛應(yīng)用于紡織品和地毯等表面防污處理劑、涂料、泡沫滅火劑、農(nóng)藥及其他表面活性劑產(chǎn)品中[9]。PFOS不僅很難降解，還有可能通過食物、空氣和水進(jìn)入人體。人們已經(jīng)在水體、生物體、人體組織和食物中廣泛檢出了PFOS[10-11]。PFOS的毒性也同樣引起人們的重視。PFOS引起的毒性效應(yīng)主要有肝臟毒性[12]、神經(jīng)毒性[13]、免疫毒性、生殖毒性[14]和發(fā)育毒性[15]等。Du等[12]發(fā)現(xiàn)長期暴露在PFOS的水中，可以誘導(dǎo)斑馬魚的肝臟毒性。Keiter等[16]發(fā)現(xiàn)PFOS可以誘導(dǎo)斑馬魚肝臟，甲狀腺和性腺發(fā)生病變。端正花等[17]發(fā)現(xiàn)PFOS對(duì)人體正常肝細(xì)胞增殖具有顯著毒性。

環(huán)境中的污染物正趨于多元化和復(fù)雜化，環(huán)境污染以各種污染物構(gòu)成的復(fù)合污染為主[18]，在這種狀態(tài)下，多種污染物共存于同一環(huán)境并相互作用。僅僅用單一污染物的作用機(jī)理已無法解釋污染物間相互作用的環(huán)境效應(yīng)。因此，混合物聯(lián)合作用的研究具有非常重要的意義，它能為環(huán)境標(biāo)準(zhǔn)的制定和生態(tài)風(fēng)險(xiǎn)評(píng)價(jià)提供更可靠的依據(jù)。Zhang等[19]發(fā)現(xiàn)納米二氧化鈦能夠增加Cd在鯉魚體內(nèi)的積累。Kim等[20]發(fā)現(xiàn)PFOS能夠增強(qiáng)Cd在斑馬魚生命階段早期的毒性作用。Keiter等[16]發(fā)現(xiàn)當(dāng)斑馬魚親本代暴露于PFOS和雙酚A溶液中4個(gè)月后，子代的存活率顯著下降。NPs可以與環(huán)境中其他化學(xué)物相互作用，從而聯(lián)合發(fā)揮對(duì)生物系統(tǒng)和環(huán)境的影響。PFOS和Nano-ZnO在河流、土壤和沉積物中廣泛存在，使得他們?cè)谒h(huán)境中同時(shí)存在的幾率增大。

粒子誘導(dǎo)氧化應(yīng)激是生物學(xué)的一種重要的機(jī)械模式，以此為基礎(chǔ)預(yù)測模型研究毒性[21]。氧化應(yīng)激是誘導(dǎo)氧化損傷的一種常見途徑，生物的抗氧化系統(tǒng)是生物為了避免內(nèi)外源化學(xué)物質(zhì)的損害而通過長期進(jìn)化形成的酶解系統(tǒng)。當(dāng)生物處于污染的環(huán)境中，可誘導(dǎo)抗氧化系統(tǒng)酶活性的變化，并可定量檢測。凋亡是細(xì)胞程序性死亡(PCD)的過程，發(fā)生在多細(xì)胞生物。半胱天冬酶家族(caspase)在細(xì)胞內(nèi)凋亡信號(hào)的感應(yīng)、傳到和放大中扮演至關(guān)重要的作用[22]。p53蛋白調(diào)節(jié)多細(xì)胞生物細(xì)胞周期和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[23]。p53被激活時(shí),它誘導(dǎo)線粒體膜Bax基因的表達(dá)，然后激活效應(yīng)caspase-3基因表達(dá)[24]。Bcl-2作為一個(gè)典型的抗氧化劑對(duì)抗氧化應(yīng)激，防止細(xì)胞凋亡[25]。

目前國內(nèi)外對(duì)于PFOS和Nano-ZnO的單一毒性研究已經(jīng)有很多報(bào)道，但這兩種化合物對(duì)于水生生物的聯(lián)合毒性作用，卻很少有報(bào)道。本文通過酶活性變化和基因表達(dá)情況，以此研究二者復(fù)合引起的氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷毒性作用。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)魚：成年AB品系斑馬魚(Danio rerio)由中國科學(xué)院武漢水生生物研究所提供。斑馬魚體長約為3～4 cm，養(yǎng)殖于經(jīng)活性炭和珊瑚砂過濾的標(biāo)準(zhǔn)化紫外滅菌循環(huán)水箱內(nèi)。斑馬魚(雌雄性比例1：2)飼養(yǎng)在水箱中，水溫控制為28±1 ℃，光照周期明暗比為14 h：10 h，控制飼養(yǎng)一個(gè)月左右開始收集魚卵。飼養(yǎng)水中加入營養(yǎng)鹽(294 mg·L-1CaCl2·2H2O、123.3mg·L-1MgSO4·7H2O、63.0 mg·L-1NaHCO3和5.5 mg·L-1KCl)，pH保持7.0左右，每日喂2次豐年蟲。

1.2 儀器和試劑

儀器：水平電泳儀(DYY-6C，北京六一儀器廠)，Waters高效液相色譜/串聯(lián)質(zhì)譜儀OA/SPE-MS/MS，掃描電子顯微鏡(SEM, Philips XL30, FEI Company)，透射電子顯微電鏡(JEOL, Tokyo, Japan)，動(dòng)態(tài)光散射儀(Brookhaven Instrument Corporation, Holtsville, NY, USA)，UVP凝膠圖像分析儀(VilberLourmat)，PCR儀和CEX96TM Real-TimePCR儀(Bio-Rad)，電感耦合等離子體質(zhì)譜儀(ICP-MS, Thermo Elemental X7, Thermo Electron Co., USA)，定量PCR儀器(American, ABI)。

試劑：全氟辛烷磺酸鉀(PFOS: C8F17KO3S；CAS no: 2795-36-3；純度≥98%，Sigma公司)；全氟辛烷磺酸鉀(PFOS: C8F17SO3H；CAS no:2795-36-3；分析標(biāo)準(zhǔn)品，Sigma公司)；二甲亞砜(DMSO; ≥99.9%，Sigma公司)；納米氧化鋅粒子分散液(CAS no:1314-13-2,<100 nm，Sigma公司)；測酶活性試劑盒，南京建成科技有限公司；Trizol試劑，PrimeScript RT reagents Kit試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTM試劑盒( TaKaRa)。其他試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 Nano-ZnO的表征分析

SEM分析：將Nano-ZnO水溶液滴在含導(dǎo)電膠的鋁片上，室溫晾干后噴金，將其置于掃描電鏡下拍照；TEM形貌觀察：將Nano-ZnO水溶液滴在銅網(wǎng)上，用鑷子取出，在濾紙上晾干，將銅片置于透射電鏡下拍照；DLS粒徑分析：配置12.5，25和50 mg·L-1濃度的Nano-ZnO水溶液于10 mL玻璃管中，用動(dòng)態(tài)光散射(DLS)分析Nano-ZnO在水溶液中的粒徑分布。

SEM圖片(圖1A)與TEM 圖片(圖1B)顯示其顆粒基本呈單顆粒狀態(tài)，雖部分顆粒聚集在一起，但無明顯團(tuán)聚態(tài)。DLS(圖1B)結(jié)果表明Nano-ZnO顆粒粒徑均分布在100 nm 以下，集中分布在40～60 nm 左右，平均粒徑為50 nm，表明Nano-ZnO粒徑達(dá)到納米級(jí)別(1～100 nm)。

1.3.2 斑馬魚毒性實(shí)驗(yàn)

首先進(jìn)行預(yù)實(shí)驗(yàn)確定暴露濃度。將斑馬魚的胚胎暴露在PFOS溶液(0，1，2，4，8，16 mg·L-1)和Nano-ZnO溶液(1，5，10，20，50，100，200 mg·L-1)中96 h，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)平行，每隔24小時(shí)統(tǒng)計(jì)胚胎死亡率，用寇氏法[26]算得PFOS 96h的LC50為3.502 mg·L-1(95%的置信區(qū)間為2.369～5.051 mg·L-1)，Nano-ZnO的96 h的LC50為60 mg·L-1(95%的置信區(qū)間為83.35～44.16 mg·L-1)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示胚胎暴露在1.6 mg·L-1的PFOS中死亡率與暴露在50 mg·L-1的Nano-ZnO的死亡率相同均為25%，表一所示。根據(jù)1：1等毒性配比，我們選擇Nano-ZnO(0，12.5，25，50 mg·L-1)、PFOS(0，0.4，0.8，1.6 mg·L-1)單獨(dú)暴露組和Nano-ZnO+PFOS(12.5+0.4，25+0.8，1.6+50 mg·L-1)復(fù)合暴露組進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。暴露時(shí)間選擇開始于胚胎產(chǎn)出6小時(shí)到144小時(shí)為止。

圖1 Nano-ZnO (50 mg·L-1)在掃描電鏡(A)、透射電鏡(B)和動(dòng)態(tài)光衍射下的粒徑分布情況Fig. 1 SEM images (A) of a Nano-ZnO suspension of 50 mg·L-1; TEM images (B) of a Nano-ZnO suspension of 50 mg·L-1;particle size distribution (B) histogram of Nano-ZnO obtained from DLS

以斑馬魚培養(yǎng)水為對(duì)照溶液，在500 mL燒杯中分別加入上述溶液200 mL，每個(gè)燒杯中隨機(jī)放入發(fā)育正常的200個(gè)斑馬魚胚胎，每個(gè)濃度設(shè)置3個(gè)重復(fù)，試驗(yàn)重復(fù)3次。試驗(yàn)進(jìn)行6天，每天換1次染毒液。6天后，用離心管收集斑馬魚，勻漿取上清，勻漿前，用PBS(pH=7.4)緩沖液潤洗，用吸管吸去離心管中水分并稱重，加入4倍體積預(yù)冷的PBS緩沖液，冰浴下，用玻璃勻漿管勻漿后于4 ℃離心(4 000 rmin-1，20 min)，取上清液保存于4℃用于酶活性測定(24 h內(nèi)測完)。在溶液中暴露6天后，收集用于基因分析的樣品并儲(chǔ)存在-80℃冰箱中待用。

1.3.3 生化指標(biāo)測定

蛋白含量的測定采用考馬斯亮藍(lán)法，以牛血清白蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，樣品與考馬斯亮藍(lán)G250按體積比1：5混合，測定波長595 nm。SOD，Gpx，CAT，Caspase-3，Caspase-9活性以及MDA含量測定，均采用購自南京建成生物公司的檢測試劑盒，有關(guān)操作參照說明書進(jìn)行。

1.3.4 斑馬魚胚胎中相關(guān)凋亡基因Real-time PCR測定

用Trizol抽提出斑馬魚的總RNA，利用核酸蛋白儀測出RNA濃度，UVP凝膠圖像分析儀凝膠電泳，利用PrimeScript RT reagentsKit試劑盒將總RNA反轉(zhuǎn)錄成cDNA；然后用SYBRPremix Ex TaqTM試劑盒進(jìn)行Real-time PCR。以上實(shí)驗(yàn)步驟均按說明書操作。實(shí)驗(yàn)結(jié)果用2-ΔΔCt方法分析數(shù)據(jù)，引物序列見表2。

1.3.5 化學(xué)分析

新鮮配置一系列濃度的Nano-ZnO懸浮液，每個(gè)濃度懸浮液在24 h后采樣分析溶解的Zn2+。Nano-ZnO懸浮液在10 000 g·min-1重力下離心30 min，取上清用ICP-MS測定溶液中Zn2+的含量。

新鮮配置一系列濃度的PFOS溶液，每個(gè)濃度溶液在24 h后采樣，過0.22 μm尼龍濾膜，參照Skutlarek等[27]固相萃取和液體色譜串聯(lián)質(zhì)譜分析方法，進(jìn)行PFOS濃度分析。

表1 PFOS andNano-ZnO暴露下斑馬魚胚胎96h的死亡率

表2 實(shí)驗(yàn)中所用的引物序列

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

實(shí)驗(yàn)結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差”即(mean±SD)表示。采用SPSS18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，多組間比較采用方差齊性檢驗(yàn)和單因素方差分析(One Way ANOVA)。進(jìn)一步進(jìn)行組間兩兩比較時(shí)，采用LSD和Dunnett T3檢驗(yàn)，以P<0.05表示表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析(Results and analysis)

2.1 化學(xué)分析

由ICP-MS的實(shí)驗(yàn)結(jié)果可知，Zn2+的濃度在Nano-ZnO單獨(dú)暴露組(12.5，25和50 mg·L-1)的溶液中分別為9.85，9.22和22.58 mg·L-1。此外，Zn2+的濃度在PFOS和Nano-ZnO復(fù)合暴露組(0.4+12.5，0.8+25和1.6+50 mgL-1)中分別為5.25，13.15和30.38 mg·L-1。經(jīng)OA/SPE-MS/MS分析，得到線性方程為Y=88133.5X+14149.75 (R2=0.996)，其中Y為二級(jí)子離子(m/z499.2>79.9)的峰面積，X為PFOS的質(zhì)量濃度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明PFOS在0.05～1.8 mg·L-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。PFOS在單獨(dú)暴露懸浮液(0.4，0.8和1.6 mg·L-1)中的濃度為0.33，0.64和1.23 mg·L-1。PFOS在與Nano-ZnO復(fù)合暴露懸浮液(0.4+12.5，0.8+25和1.6+50 mg·L-1)中的濃度分別為0.31，0.54和1.19 mg·L-1。

2.2 PFOS和Nano-ZnO暴露對(duì)斑馬魚氧化酶活性影響

由圖2A可以看出，PFOS和Nano-ZnO均能誘導(dǎo)斑馬魚SOD酶活性變化。SOD的活性在PFOS和Nano-ZnO處理組中除0.4和0.8 mg·L-1PFOS單獨(dú)暴露組外均與對(duì)照組相比顯著升高(P<0.05)。0.4和0.8 mg·L-1PFOS 單獨(dú)處理組分別與PFOS 0.4 mg·L-1+Nano-ZnO 12.5 mg·L-1和PFOS 0.8 mg·L-1+Nano-ZnO 25 mg·L-1復(fù)合暴露組相比差異顯著(P<0.05)。

由圖2B可知，PFOS和Nano-ZnO均能抑制斑馬魚CAT酶的活性并且與濃度變化呈現(xiàn)劑量效應(yīng)關(guān)系。CAT的活性在Nano-ZnO單獨(dú)處理組、Nano-ZnO 12.5 mg·L-1復(fù)合處理組和Nano-ZnO 50 mg·L-1復(fù)合處理組中與對(duì)照相比差異顯著(P<0.05)。在PFOS 1.6 mg·L-1和Nano-ZnO 25 mg·L-1單獨(dú)處理組中，與其對(duì)應(yīng)的復(fù)合處理組差異顯著，說明在復(fù)合溶液中，斑馬魚的氧化損傷程度更加明顯。

PFOS和Nano-ZnO暴露對(duì)斑馬魚幼魚Gpx活性的影響如圖1-C所示，各暴露組Gpx活性顯著上升，不同濃度暴露存在一定的劑量依賴效應(yīng)。Gpx的活性在PFOS和Nano-ZnO處理組中均高于對(duì)照組，除0.4和0.8 mg·L-1PFOS單獨(dú)暴露組外，Gpx的活性隨著濃度的升高與對(duì)照組相比顯著增加(P<0.05)。通過觀察濃度-劑量關(guān)系，1.6 mg·L-1PFOS單獨(dú)暴露組誘導(dǎo)率達(dá)到對(duì)照組的3.33倍，50 mg·L-1Nano-ZnO單獨(dú)暴露組誘導(dǎo)率達(dá)到對(duì)照組的3.74倍。Gpx的活性在PFOS單獨(dú)處理組、Nano-ZnO 12.5 mg·L-1單獨(dú)處理組和Nano-ZnO 50 mg·L-1單獨(dú)處理組中與其等濃度對(duì)應(yīng)的復(fù)合處理組相比差異顯著(P<0.05)。

PFOS和Nano-ZnO暴露對(duì)斑馬魚幼魚MDA活性的影響如圖1-D所示，在所有暴露組，不同暴露濃度下，MDA的含量均高于對(duì)照組。1.6 mg·L-1PFOS單獨(dú)暴露組和所有的復(fù)合處理組與對(duì)照組相比差異顯著(P<0.05)。在25 mg·L-1及 50 mg·L-1Nano-ZnO復(fù)合暴露組中，MDA含量達(dá)到最大值，分別為對(duì)照組的4.61和5.7倍。0.8、1.6 mg·L-1PFOS單獨(dú)處理組合和25、50 mg·L-1Nano-ZnO單獨(dú)處理組與其等濃度對(duì)應(yīng)的復(fù)合處理組相比差異顯著(P<0.05)。

2.3 PFOS和Nano-ZnO暴露對(duì)斑馬魚細(xì)胞凋亡酶活性影響

為探討PFOS和Nano-ZnO誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是否由Caspase依賴性途徑引起，測定了Caspase-3和Caspase-9酶的活性，實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖3所示：在0.8 mg·L-1PFOS復(fù)合暴露組和1.6 mg·L-1PFOS單獨(dú)與復(fù)合暴露組中，Caspase-3和Caspase-9活性相比對(duì)照組顯著升高。并且Caspase-3和Caspase-9酶活性在0.8 mg·L-1PFOS單獨(dú)暴露組其對(duì)應(yīng)的復(fù)合暴露組相比差異顯著(P<0.05)。另外，在Nano-ZnO所有單獨(dú)處理組中，Caspase-3及Caspase-9活性與其復(fù)合處理組差異顯著(P<0.05)。隨著暴露濃度的增加，Caspase-3及Caspase-9活性誘導(dǎo)率上升，0.8和1.6 mg·L-1PFOS復(fù)合暴露時(shí)，誘導(dǎo)率達(dá)到最大，分別為對(duì)照組的6.47和4.21倍顯著高于對(duì)照組。Caspase-3及Caspase-9酶活性在1.6 mg·L-1PFOS復(fù)合暴露組與對(duì)照差異顯著。

2.4 PFOS和Nano-ZnO暴露對(duì)斑馬魚細(xì)胞凋亡基因表達(dá)影響 不同濃度PFOS和Nano-ZnO暴露6天后，分別測定p53、Bax和Bcl-2的表達(dá)情況，測定結(jié)果如圖4所示：相比對(duì)照組，其他暴露組p53和Bax表達(dá)呈上升趨勢，并與暴露濃度呈現(xiàn)一定的劑量依賴性效應(yīng)。在PFOS 1.6 mg·L-1復(fù)合暴露組中，p53和Bax上調(diào)幅度均大于單獨(dú)暴露組，并且為其單獨(dú)暴露組的1.31倍和1.68倍。PFOS 1.6 mg·L-1單獨(dú)暴露組和Nano-ZnO 50 mg·L-1單獨(dú)與復(fù)合暴露組與對(duì)照相比p53表達(dá)顯著上升。PFOS 0.4 mg·L-1與所有Nano-ZnO單獨(dú)處理組p53的表達(dá)與相應(yīng)復(fù)合暴露組相比差異顯著(P<0.05)。如圖4B所示，PFOS 1.6 mg·L-1單獨(dú)暴露組和Nano-ZnO 50 mg·L-1單獨(dú)暴露組與對(duì)照和相應(yīng)的復(fù)合暴露組相比差異顯著(P<0.05)。而在處理組中Bcl-2基因表達(dá)與對(duì)照組相比呈現(xiàn)下調(diào)趨勢，最高濃度的復(fù)合暴露組與對(duì)照有顯著差異(p<0.05)，下調(diào)幅度達(dá)到對(duì)照組的0.31倍。1.6 mg·L-1PFOS單獨(dú)處理組和50 mg·L-1Nano-ZnO單獨(dú)處理組與其對(duì)應(yīng)的復(fù)合處理組相比差異顯著(P<0.05)，并且復(fù)合暴露組Bcl-2基因下調(diào)的趨勢明顯大于單獨(dú)暴露組。

圖2 PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對(duì)斑馬魚SOD (A)，CAT (B)，Gpx (C)活性和MDA(D)含量的影響注：*代表PFOS或Nano-ZnO單獨(dú)處理組與其相同濃度的復(fù)合處理組有顯著差異P<0.05。# 代表與對(duì)照組有顯著差異P<0.05。Fig. 2 SOD (A), CAT (B) and Gpx activities (C) and MDA content (D) in zebrafish embryos afterexposure in PFOS combined with Nano-ZnONote: *Indicate that PFOS or Nano-ZnOsingle-exposure have statistically significant difference from the same concentration of PFOS andNano-ZnOco-exposure at P<0.05 level. # Indicate a statistically significant difference from control at P<0.05 level.

圖3 PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對(duì)斑馬魚Caspase-3和Caspase-9活性影響注：*代表PFOS或Nano-ZnO單獨(dú)處理組與其相同濃度的復(fù)合處理組有顯著差異P<0.05。# 代表與對(duì)照組有顯著差異P<0.05。Fig. 3 Changes in the Caspase-3 (A) and Caspase-9 (B) activities of zebrafish larvae afterexposure to various concentrations of PFOS and ZnO-NPsNote: *Indicate that PFOS or Nano-ZnOsingle-exposure have statistically significant difference from the same concentrationof PFOS and Nano-ZnO co-exposure at P<0.05 level. # Indicate a statistically significant difference from control at P<0.05 level

圖4 PFOS和Nano-ZnO不同濃度處理對(duì)斑馬魚p53 (A), Bax (B) and Bcl-2 (C)的基因表達(dá)影響。注：*PFOS或Nano-ZnO單獨(dú)處理組與其相同濃度的復(fù)合處理組有顯著差異P<0.05, # 代表與對(duì)照組有顯著差異P<0.05。Fig. 4 Expression levels of the p53 (A), Bax (B) and Bcl-2 (C) genes expression levels in zebrafishembryos after exposure in PFOS combined with ZnO-NPsNote: *Indicate that PFOS or Nano-ZnOsingle-exposure have statistically significant difference from the same concentration of PFOS andNano-ZnO co-exposure at P<0.05 level. # Indicate a statistically significant difference from control at P<0.05 level.

3 討論 (Discussion)

本研究通過對(duì)一些典型氧化應(yīng)激和凋亡酶活性，以及與凋亡通路相關(guān)基因表達(dá)的測定，首次證明了PFOS和Nano-ZnO共同暴露可以誘導(dǎo)斑馬魚早期發(fā)育階段的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡損傷。在PFOS和Nano-ZnO暴露的整個(gè)階段中，協(xié)同效應(yīng)起著重要的作用。

SOD是抗氧化酶系統(tǒng)中最先起作用的特異性酶，在生物體胞漿和線粒體中普遍存在，通常比其他抗氧化酶更為敏感。毒物暴露后，SOD以自由基為底物，將超氧陰離子(O2-)催化歧化為O2和H2O2，將ROS維持在適宜范圍內(nèi)，保護(hù)機(jī)體免受O2-毒性損傷[28-29]。CAT是位于過氧化物酶體中的含鐵血蛋白抗氧化酶，能促使機(jī)體內(nèi)H2O2代謝為O2和H2O[30]，避免毒性更強(qiáng)的·OH的產(chǎn)生，從而保護(hù)機(jī)體免受毒物傷害。Gpx可清除·OH和ROS等誘導(dǎo)的脂質(zhì)過氧化物，保護(hù)細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)和功能的完整性。MDA作為LPO穩(wěn)定的降解產(chǎn)物，可使酶蛋白交聯(lián)并失活，破壞膜結(jié)構(gòu)和功能[31]。因此，常用MDA含量變化判斷質(zhì)膜損傷及脂質(zhì)過氧化程度。在本研究中，SOD，Gpx的活性和MDA的含量隨著有毒物質(zhì)的濃度增加呈現(xiàn)上升的趨勢，并在復(fù)合暴露組中與單獨(dú)暴露組相比顯著增加(圖2)。而CAT的活性隨著處理濃度的增加呈現(xiàn)下降的趨勢，在復(fù)合暴露組中下降趨勢大于單獨(dú)暴露組(圖2)。Zhao等[32]發(fā)現(xiàn)Nano-ZnO能夠誘導(dǎo)斑馬魚胚胎的發(fā)育毒性，氧化應(yīng)激和DNA損傷。Xiong等[33]報(bào)道了5 mg·L-1Nano-ZnO誘導(dǎo)斑馬魚的肝臟和鰓產(chǎn)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。PFOS同樣也導(dǎo)致鼠肺產(chǎn)生氧化損傷[34]。這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)單獨(dú)PFOS和Nano-ZnO毒性結(jié)果類似。同時(shí)，Kim等[20]發(fā)現(xiàn)預(yù)先暴露PFOS可以影響抗氧化防御機(jī)制并且加強(qiáng)Cd的毒性。本實(shí)驗(yàn)中相關(guān)酶活性的改變說明氧化應(yīng)激機(jī)制是PFOS和Nano-ZnO誘導(dǎo)斑馬魚體內(nèi)毒性的一個(gè)重要機(jī)制。

Caspase是細(xì)胞內(nèi)蛋白酶，作為細(xì)胞凋亡的感應(yīng)和引發(fā)劑，是轉(zhuǎn)導(dǎo)凋亡信號(hào)的共同通路。細(xì)胞凋亡的很多調(diào)控途徑都是由Caspase酶發(fā)揮作用。Caspase-3和Caspase-9也被認(rèn)定為魚早期生命階段應(yīng)激誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的重要指標(biāo)[35]。如圖3所示，PFOS和Nano-ZnO暴露顯著誘導(dǎo)了斑馬魚胚胎Caspase-3和Caspase-9的活性上升。Wang等[36]報(bào)道了Nano-ZnO誘導(dǎo)星形膠質(zhì)細(xì)胞的Caspase-3酶的活性變化。Chen等[34]證明了PFOS能偶誘導(dǎo)老鼠肺部Caspase-3和Caspase-9酶活性的上調(diào)。

P53是一種腫瘤抑制基因，可以調(diào)控多種基因的表達(dá)，p53上調(diào)可以導(dǎo)致細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡[37]。被激活的p53基因誘導(dǎo)線粒體膜中促凋亡基因Bax的表達(dá)，降低線粒體膜電位，增加膜透性，導(dǎo)致凋亡誘導(dǎo)蛋白細(xì)胞色素C的釋放，促使下游的caspase-9激活，進(jìn)而繼續(xù)激活caspase-3活性[38]，加速細(xì)胞死亡過程。Bcl-2作為一個(gè)典型的抗氧化劑，能夠?qū)寡趸瘔毫Γ乐辜?xì)胞凋亡[25]。本研究為了闡明PFOS和Nano-ZnO暴露誘導(dǎo)的斑馬魚仔魚細(xì)胞凋亡途徑，對(duì)細(xì)胞凋亡相關(guān)基因進(jìn)行了考察，研究結(jié)果顯示，PFOS和Nano-ZnO單獨(dú)和復(fù)合暴露均能引起細(xì)胞凋亡反應(yīng)，且復(fù)合暴露引起的凋亡程度大于單獨(dú)暴露，證明在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)復(fù)合暴露對(duì)斑馬魚細(xì)胞凋亡損傷呈現(xiàn)協(xié)同趨勢。Liu等[39]發(fā)現(xiàn)PFOS能夠誘導(dǎo)Bax的基因在斑馬魚胚胎中表達(dá)。Wang等[36]證明Nano-ZnO誘導(dǎo)Bax基因在星形膠質(zhì)細(xì)胞中表達(dá)。Ahamed等人報(bào)道了Nano-ZnO通過p53，Bax和Bcl-2路徑誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[40]。以上研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果類似。

通過ICP-MC結(jié)果可以看出，在0.8+25 mg·L-1和1.6+50 mg·L-1復(fù)合暴露組中Zn2+的濃度大于單獨(dú)暴露組，而0.4+12.5 mg·L-1復(fù)合暴露組中的Zn2+濃度小于單獨(dú)暴露組。經(jīng)OA/SPE-MS/MS分析結(jié)果可知，在復(fù)合暴露組中PFOS的濃度小于單獨(dú)暴露組。Wang等[41]報(bào)道稱Nano-ZnO在溶液中可以釋放Zn2+， Harada等[42]年發(fā)現(xiàn)PFOS在溶液中可以釋放磺酸集團(tuán)。PFOS和Nano-ZnO在溶液中的共同作用可以解釋為Zn2+和磺酸集團(tuán)的相互作用。根據(jù)PFOS和Nano-ZnO結(jié)構(gòu)的特點(diǎn)我們推測，復(fù)合毒性潛在的原因和機(jī)制假設(shè)如下：表面活性劑PFOS能夠破壞脂質(zhì)結(jié)構(gòu)，破壞細(xì)胞膜[43]，進(jìn)而使納米粒子更易穿透細(xì)胞膜造成生物體損害。張陽等[44]發(fā)現(xiàn)Nano-ZnO可以在斑馬魚成魚體內(nèi)富集，排除較為緩慢且清除率較低。Desagher和Martinou[45]發(fā)現(xiàn)線粒體膜電位介導(dǎo)通路參與ZnO-NPs誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，這些觀點(diǎn)進(jìn)一步研究證明了我們的推測。Anselmo等[46]發(fā)現(xiàn)PFOS和一些納米粒子損傷機(jī)體的一種多異型生物質(zhì)阻力機(jī)制，這種機(jī)制的破壞可以導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)其他化合物含量的增多，增加細(xì)胞毒性。以這些理論和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)，我們認(rèn)為PFOS和Nano-ZnO在試驗(yàn)濃度范圍內(nèi)的聯(lián)合毒性作用類型為協(xié)同作用。

本文研究了PFOS和Nano-ZnO復(fù)合后短期暴露對(duì)斑馬魚胚胎氧化應(yīng)激和細(xì)胞損傷影響，為環(huán)境中復(fù)合污染物的毒性評(píng)價(jià)提供了依據(jù)，但二者復(fù)合后在生物體內(nèi)的運(yùn)輸和代謝機(jī)理尚不清楚，還有待進(jìn)一步的研究。

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◆

PFOS and ZnO Nanoparticles Induced Oxidative Stress and Apoptosis in Zebrafish (Daniorerio)

Du Jia,Wang Shutao1, Liu Zheng1, You Hong1,2,*

1. State Key Laboratory of Urban Water Resource and Environment, Harbin Institute of Technology, 150090 2. School of Marine Science and Technology, Harbin Institute of Technology at Weihai, Weihai64209

Received 21 November 2014 accepted 4 January 2015

Oxidative stress and apoptosis to zebrafish (Danio rerio) embryos induced by perfluorooctanesul phonic acid potassium salt, (PFOS) and ZnO nanoparticles (Nano-ZnO) were investigated in this study. The embryos were exposed to PFOS (0、0.4、0.8 and 1.6 mg·L-1) single solutions, Nano-ZnO (0、12.5、25 and 50 mg·L-1) single solutions and PFOS plus Nano-ZnO (0、0.4+12.5、0.8+25 and 1.6+50 mg·L-1) mixture solutions for 144 hour post-fertilisation (hpf). Activities of superoxide dismutase (SOD), catalase (CAT), glutathione peroxidase (Gpx) and malondialdehyde(MDA) contents were measured in zebrafish after exposure for 144 hpf. At the same time, the levels of gene expression related to apoptosis (Bax, p53 and Bcl-2) were also measured. The results demonstrated that both PFOS and Nano-ZnO single- and co-exposure induced oxidative stress and apoptosis. In addition, PFOS plus Nano-ZnO exposure caused more serious oxidative stress and apoptosis than PFOS and Nano-ZnO single-exposure at above exposure concentrations. Several apoptosis pathways related genes such as Bax and p53 were significantly up-regulated in PFOS and Nano-ZnO co-exposure groups. Anti-apoptotic gene such as Bcl-2 was significantly down-regulated in PFOS and Nano-ZnO co-exposure groups. Under the toxicity ratio of 1:1, Nano-ZnO increased the toxicity of PFOS on oxidative stress and apoptosis in zebrafish embryos at the experimental concentrations.

ZnO nanoparticles (Nano-ZnO); perfluorooctanesul phonic acid potassium salt (PFOS); oxidative stress; apoptosis; joint toxicity

哈爾濱工業(yè)大學(xué)城市水資源與水環(huán)境國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室導(dǎo)向類自主課題(2013DX09)

杜佳(1986-)，女，博士，研究方向?yàn)榄h(huán)境毒理學(xué)，E-mail: dujia532158064@163.com

*通訊作者(Corresponding author)， E-mail: youhong@hit.edu.cn

10.7524/AJE.1673-5897-20141121001

2014-11-21 錄用日期：2015-01-04

1673-5897(2015)3-238-10

X171.5

A

尤宏(1961-)，男，黑龍江省哈爾濱市人，教授，博士，工業(yè)廢水深度處理與回用技術(shù)；近五年來主持和參加包括國家“973計(jì)劃”課題、國家“863計(jì)劃”課題、國家科技重大專項(xiàng)課題、省科技攻關(guān)項(xiàng)目、國際合作項(xiàng)目課題等10余項(xiàng)。獲得黑龍江省科技進(jìn)步二等獎(jiǎng)、環(huán)境保護(hù)部環(huán)保科技二等獎(jiǎng)等省部級(jí)科研獎(jiǎng)3項(xiàng)。發(fā)表論文60余篇，獲得授權(quán)專利5件，軟件著作權(quán)2件。

杜佳，王樹濤，劉征，等. 全氟辛烷磺酸鉀(PFOS)和納米氧化鋅(Nano-ZnO)單獨(dú)與聯(lián)合暴露對(duì)斑馬魚胚胎的氧化損傷和細(xì)胞凋亡的影響[J]. 生態(tài)毒理學(xué)報(bào)，2015, 10(3): 238-247

Du J, Wang S T, Liu Z, et al. PFOS and ZnO nanoparticles induced oxidative Stress and apoptosis in zebrafish (Danio rerio) [J]. Asian Journal of Ecotoxicology, 2015, 10(3): 238-247 (in Chinese)