創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙對大鼠腸系膜和軟腦膜微循環(huán)的影響*

劉　蜜　宋丹丹　李玉珍　徐菲菲　陶天琪　李　冬　劉秀華　郭渝成

guoyucheng717@163.com

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙對大鼠腸系膜和軟腦膜微循環(huán)的影響*

劉蜜宋丹丹李玉珍徐菲菲陶天琪李冬劉秀華郭渝成#

guoyucheng717@163.com

【摘要】目的：研究創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 (PTSD) 大鼠腸系膜和軟腦膜微循環(huán)的改變及其機(jī)制。方法：成年健康雄性SD大鼠18只，隨機(jī)分為正常對照組 (n=6) 和PTSD組 (n=12)。采用單程延長刺激法復(fù)制PTSD大鼠模型，通過曠場實(shí)驗(yàn)檢測大鼠的行為學(xué)改變；采用活體微循環(huán)觀測技術(shù)觀察大鼠腸系膜及軟腦膜微血管內(nèi)徑和血流速度的改變；采用ELISA檢測大鼠血漿去甲腎上腺素 (NA)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (eNOS) 和內(nèi)皮素-1 (ET-1)水平。結(jié)果：與正常對照組比較，PTSD組大鼠在曠場中穿行格數(shù)及直立次數(shù)顯著減少 (P<0.01)；腸系膜及軟腦膜細(xì)動脈、細(xì)靜脈管徑明顯變細(xì)(P<0.05)，血流速度趨緩；血漿NA和ET-1含量顯著升高 (P<0.01)，但eNOS水平無顯著變化 (P>0.05)。結(jié)論：PTSD大鼠存在腸系膜和軟腦膜微循環(huán)障礙。

【關(guān)鍵詞】創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙；腸系膜；軟腦膜；微循環(huán)；大鼠

Post-traumatic Stress Disorder on the Microcirculation of Mesentery and Cerebral Pia Mater in Rats

LIU Mi, SONG Dan-dan, LI Yu-zhen, XU Fei-fei, TAO Tian-qi, LI Dong, LIU Xiu-hua, GUO Yu-cheng#

Department of Pathophysiology, Chinese PLA General Hospital, Beijing 100853, China；#Corresponding author

【Abstract】Objective: To investigate the effect of post-traumatic stress disorder (PTSD) on microcirculation of mesentery and cerebral pia mater in rats and the underlying mechanisms. Method: Sprague-Dawley (SD) rats were randomly divided into two groups: control group (n=6) and PTSD group (n=12). The PTSD model was replicated by using the single prolonged stress method. On the 14th day post-stress, the changes of animals' behavior was evaluated via open-field; the microcirculation of mesentery and cerebral pia mater of rats was observed using the microscope; the plasma noradrenaline (NA), endothelial nitric oxide synthase (eNOS) and endothelin-1 (ET-1) were measured by using enzyme linked immunosorbent assay (ELISA).Results: Compared with the control rats, the numbers of crossing and rearing of the PTSD rats were decreased significantly in the open-field (P<0.01); the diameters of arteriole and veinule in the mesentery and cerebral pia mater from the PTSD rats were significantly thinner (P<0.05), the blood flow velocity showed the trend of slowed down; the plasma levels of NA and ET-1 were elevated significantly (P<0.01); there was no significant difference in the plasma level of eNOS (P>0.05).Conclusion: PTSD induces microcirculation dysfunction in mesentery and cerebral pia mater in rats.

【Key words】Post-traumatic stress disorder; Mesentery; Cerebral piamater; Microcirculation;Rat

創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙 (Post-traumatic Stress Disorder, PTSD) 指個體由于經(jīng)歷對生命具有威脅的事件或嚴(yán)重創(chuàng)傷 (如戰(zhàn)爭、自然災(zāi)害及性侵害等)，導(dǎo)致一系列精神癥狀長期存在的精神障礙，被認(rèn)為是心血管疾病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[1-3]；微循環(huán)是心血管系統(tǒng)的重要組成部分，微循環(huán)障礙與心血管疾病的發(fā)生、發(fā)展和預(yù)后密切相關(guān)。PTSD與微循環(huán)的關(guān)系已受到臨床應(yīng)用研究的關(guān)注。

血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是心血管病的始動環(huán)節(jié)之一[4]。心理應(yīng)激及精神抑郁可能導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，從而介導(dǎo)心身疾病的病理生理過程，包括微循環(huán)障礙。已有研究表明，來自工作及生活的壓力可使內(nèi)皮標(biāo)志分子血管細(xì)胞黏附因子-1和可溶性細(xì)胞間黏附因子-1血漿水平顯著增加[5]；以及抑郁癥患者肱動脈血流介導(dǎo)性舒張功能降低[6]。但有關(guān)PTSD是否通過損傷血管內(nèi)皮引起微循環(huán)障礙的直接證據(jù)尚未見報(bào)道。

本研究采用單程延長刺激 (Single Prolonged Stress, SPS)法模擬PTSD[7, 8]，活體觀察實(shí)驗(yàn)大鼠自發(fā)性活動的行為學(xué)特征；活體觀測腸系膜、軟腦膜微血管內(nèi)徑和血流速度變化及離體血液中去甲腎上腺素 (Noradrenaline, NA)、內(nèi)皮型一氧化氮合酶 (Endothelial Nitric Oxide Synthase, eNOS) 和內(nèi)皮素-1 (Endothelin-1, ET-1) 水平，初步探討PTSD對大鼠微循環(huán)的影響及其作用機(jī)制。

1材料與方法

1.1　實(shí)驗(yàn)動物

成年雄性SD大鼠18只，體重200-250g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司，動物許可證號：SCXK(京)2012-0001。光亮/黑暗周期為12h/12h，光照時間7∶00-19∶00，環(huán)境溫度為22-24℃，相對濕度50%-60%。實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，6只/籠，自由攝食飲水。

1.2　器材與試劑

自制曠場實(shí)驗(yàn)箱(由底面為80cm×80cm、高50cm，四壁光滑的不透明塑料板制成，底面被劃分成為16個20cm×20cm的等邊方格)用于觀察實(shí)驗(yàn)大鼠的自發(fā)性活動情況；自制恒溫微循環(huán)觀測盒；Olympus BH-2微循環(huán)顯微鏡購自日本Olympus公司；微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)購自徐州眾聯(lián)醫(yī)療器械有限公司；NA檢測試劑盒(批號：H20150407)、eNOS檢測試劑盒(批號：H20150408)、ET-1檢測試劑盒(批號：H20150409)均為南京建成生物工程研究所產(chǎn)品；Infinite?F200 PRO多功能酶標(biāo)儀為瑞士TECAN公司產(chǎn)品。

1.3　實(shí)驗(yàn)分組與PTSD處理

實(shí)驗(yàn)大鼠按照隨機(jī)數(shù)字表完全隨機(jī)化分為正常對照組(Control組，n=6)和PTSD組(n=12)，Control組大鼠常規(guī)飼養(yǎng)，不作任何處理。PTSD組大鼠模擬PTSD：先將大鼠置于圓錐形聚乙烯固定器中固定2h(僅尾巴可以活動)，強(qiáng)迫其游泳20min(游泳池長50cm，寬40cm，高60cm，水深40cm，水溫24℃，每次6只)；休息15min后，將大鼠放入下層盛有100%乙醚的干燥器中麻醉(約3-5min)，取出待其自然清醒后，放回籠中無干擾常規(guī)飼養(yǎng)2周。

1.4　曠場實(shí)驗(yàn)及自發(fā)活動指標(biāo)

模擬PTSD后第14天，參照文獻(xiàn)[9]方法，在暗光、無噪聲環(huán)境下，將兩組大鼠依次置于曠場實(shí)驗(yàn)箱中，用攝像頭監(jiān)視大鼠活動情況，10s適應(yīng)后，采集5min視頻資料記錄其穿行格數(shù)(三爪以上跨入臨格的次數(shù))和直立次數(shù)(兩前爪騰空1cm以上或攀附墻壁次數(shù))。

1.5　微循環(huán)觀測

為降低工作量，PTSD組樣本含量為9時已滿足實(shí)驗(yàn)所需，故PTSD組只隨機(jī)選擇9只大鼠進(jìn)行微循環(huán)觀測。

1.5.1腸系膜微循環(huán)觀測：兩組大鼠完成曠場實(shí)驗(yàn)后禁食12h，以20%烏拉坦肌肉注射(0.8ml/100g)麻醉，取仰臥位固定于手術(shù)臺上，于腹部正中作一長2cm縱行切口，輕輕牽出一段空腸，將腸系膜平鋪于37℃恒溫透明微循環(huán)觀察盒中并放置于微循環(huán)顯微鏡載物臺上，保持濕潤(不時滴加37℃生理鹽水)，采用高壓汞燈光源和微循環(huán)顯微鏡觀測系統(tǒng)觀測腸系膜微血管并錄像。在微循環(huán)圖像分析系統(tǒng)中回放錄像，在顯示器上對細(xì)靜脈和細(xì)動脈內(nèi)徑進(jìn)行測量；之后選擇細(xì)靜脈，采用陰極射線管群點(diǎn)掃描法，先調(diào)節(jié)光點(diǎn)使之與血管平行并順血流方向連續(xù)掃描，再調(diào)節(jié)其掃描速度與血流速度同步，記錄血流速度。

1.5.2軟腦膜微循環(huán)觀測：腸系膜微循環(huán)觀測完成后俯臥位固定大鼠，剪開頭頂部正中皮膚，暴露顱骨，以矢狀縫右3mm和冠狀縫后3mm交叉點(diǎn)為中心，用牙科電鉆打孔開顱窗(直徑5mm)，小心剪開硬腦膜，暴露軟腦膜，以37℃人工腦脊液棉球覆蓋保溫、保濕。同腸系膜觀測方法觀察記錄軟腦膜微血管內(nèi)徑及血流速度。

1.6　血漿NA、eNOS和ET-1水平檢測

完成微循環(huán)檢測后腹主動脈采血5ml置于檸檬酸鈉抗凝試管中，3 000rpm離心15min，分離血漿于-80℃冰箱凍存，按照試劑盒說明書集中檢測血漿NA、eNOS和ET-1水平。

1.7　統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2結(jié)果

2.1　兩組大鼠自發(fā)活動指標(biāo)比較

與Control組比較，PTSD組大鼠穿行格數(shù)及直立次數(shù)均顯著減少(P<0.01)，見表1。

表1　兩組大鼠自發(fā)活動指標(biāo)比較±s)

注：與Control組比較，1)P<0.01

2.2　兩組大鼠腸系膜及軟腦膜微循環(huán)指標(biāo)比較

Control組大鼠腸系膜及軟腦膜微血管清晰，細(xì)動脈血流速度快，呈線流，細(xì)靜脈呈線流或線粒流，未見紅細(xì)胞聚集；PTSD組大鼠腸系膜及軟腦膜細(xì)動、靜脈管徑顯著變細(xì)，腸系膜細(xì)靜脈血流速度減慢，紅細(xì)胞聚集明顯。見圖1。

2.2.1兩組大鼠腸系膜和軟腦膜微血管管徑：與Control組比較，PTSD組大鼠腸系膜和軟腦膜細(xì)靜脈、細(xì)動脈均明顯變細(xì)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義 (P<0.05或P<0.01)，見表2。

2.2.2兩組大鼠細(xì)靜脈血流速度：與Control組比較，PTSD組大鼠腸系膜和軟腦膜的細(xì)靜脈血流速度均有減慢趨勢，但差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，見表3。

表2　兩組大鼠腸系膜及軟腦膜微血管管徑比較 (μm, ±s)

注：與Control組比較，1)P<0.05，2)P<0.01

表3　兩組大鼠細(xì)靜脈血流速度比較

2.3　兩組大鼠血漿NA、eNOS及ET-1含量比較

與Control組比較，PTSD組血漿NA和ET-1含量升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01)；兩組間eNOS水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見表4。

表4　兩組大鼠血漿NA、eNOS及ET-1含量

注：與Control組比較，1)P<0.01

[本文圖1見插3]

3討論

PTSD是一種災(zāi)害后精神及行為障礙，具有發(fā)病率高、病程長等特點(diǎn)，還會直接導(dǎo)致冠狀動脈粥樣硬化性心臟病等的發(fā)生。因其交感神經(jīng)-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)持續(xù)性激活，使兒茶酚胺等持續(xù)增高，導(dǎo)致基礎(chǔ)心率加快和血壓升高[10, 11]。本研究通過SPS法模擬大鼠PTSD，采用曠場實(shí)驗(yàn)、微循環(huán)檢查和血管活性指標(biāo)分析，獲得了PTSD大鼠微循環(huán)變化特點(diǎn)及其機(jī)制的有意義數(shù)據(jù)和結(jié)果，為臨床應(yīng)用研究提供了實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

微循環(huán)是機(jī)體組織血流灌注的基本單位，又是最易損傷和發(fā)生功能障礙的特殊器官。腸系膜微循環(huán)可以反映全身微循環(huán)狀況，軟腦膜微循環(huán)是腦血管床的一部分，其管徑及血流狀態(tài)可基本反映腦微循環(huán)變化。本研究觀測發(fā)現(xiàn)，PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜細(xì)動、靜脈均較正常對照大鼠顯著收縮，且血流速度減慢，腸系膜微血管內(nèi)可見紅細(xì)胞聚集。提示PTSD可引起大鼠腸系膜和軟腦膜微循環(huán)障礙。

NA主要來自腎上腺髓質(zhì)，可激活交感-腎上腺髓質(zhì)系統(tǒng)，通過激動α受體引起腸系膜微血管收縮[12]。本研究發(fā)現(xiàn)，PTSD大鼠血漿NA水平升高與微血管收縮同時出現(xiàn)，表明高水平NA可能與PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜微血管收縮有關(guān)。

血管內(nèi)皮產(chǎn)生的旁、自分泌物ET-1也是強(qiáng)烈的縮血管活性肽，廣泛存在于各種組織和細(xì)胞中。尤以內(nèi)皮細(xì)胞受損時合成、分泌增加[13]。謝忠明等[14]研究證實(shí)高黏血癥模型兔軟腦膜微血管收縮與血漿ET-1 升高有明顯相關(guān)性；本實(shí)驗(yàn)也發(fā)現(xiàn)血漿ET-1水平升高的PTSD大鼠腸系膜及軟腦膜微血管管徑較正常對照大鼠變細(xì)。進(jìn)一步提示血漿ET-1水平增加與NA水平升高一樣，是PTSD大鼠微血管收縮的可能機(jī)制。eNOS增加可致一氧化氮 (NO) 水平升高，NO作為血管內(nèi)皮合成、分泌的最重要的血管活性物質(zhì)，具有舒張血管、抗血小板聚集、抗血管平滑肌細(xì)胞增生等作用[15]。但在本研究中未能發(fā)現(xiàn)PTSD大鼠血漿eNOS水平升高，即PTSD大鼠的血管舒張彈性較小。

綜上所述，PTSD大鼠腸系膜和軟腦膜微循環(huán)存在不同程度損害，這種微循環(huán)損害機(jī)制與其血漿NA及ET-1濃度增加有關(guān)。

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劉蜜 (1985-)，女，漢族，博士，主要從事創(chuàng)傷后應(yīng)激障礙相關(guān)心血管疾病的研究

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作者簡介：本文第一

[中圖分類號]R331.3+5

[文獻(xiàn)標(biāo)識碼]A

[文章編號]1005-1740(2015)04-0011-04

doi：10．3969／j．issn．1005－1740．2015．04．003

*[基金項(xiàng)目]“十二五”國家科技支撐計(jì)劃項(xiàng)目 (2013BA108B01)；中國博士后基金 (2014M562608)

本文2015-04-30收到，2015-09-21修回

微循環(huán)學(xué)雜志，2015，25（4）：11－14

?2015 CHINESE JOURNAL OF MICROCIRCULATION