屋塵螨過敏性哮喘患者白介素－2和白介素－4血清水平及基因多態性

楊淑紅 李 玲 王 騰 姚 頤 蘇漢文 李 艷

屋塵螨是誘發過敏性哮喘、過敏性鼻炎和濕疹等疾病的重要變應原，其發病機制尚未清楚。研究已經證實上、下呼吸道慢性過敏性炎癥表現相似，即均有Th2細胞、肥大／嗜堿性細胞、嗜酸性粒細胞以及免疫球蛋白E（ⅠgE）的參與，包括細胞因子如白介素－2（ⅠL－2）、ⅠL－4、ⅠL－13、活化正常 T細胞表達和分泌的調節物（RANTES）和粒細胞－巨噬細胞集落刺激因子（GM－CSF）、炎性化學介質等。遺傳與表觀遺傳變異之間的串擾在疾病發生和進展中至關重要，單核酸多態性（SNP）在復雜炎癥性疾病如哮喘、過敏性鼻炎和濕診中所涉及的不同基因已獲得較多關注［1］。近年研 究［2，3］表 明，ⅠL 基 因 多 態 性 與 哮 喘的發生具有一定相關性，但具體到ⅠL－2和ⅠL－4基因多態性及其血清表達水平與屋塵螨過敏性哮喘的關系尚不清楚。因此，本文檢測分析屋塵螨過敏性哮喘患者血清ⅠL－2和ⅠL－4水平及其基因多態性變化，從遺傳學角度進一步闡明屋塵螨的致病機制。

1 資料與方法

1.1 病例資料和分組

本院門診及住院首次診斷為過敏性哮喘患者73例（過敏性哮喘組），過敏原檢查提示屋塵螨是主要變應原。均符合中華醫學會呼吸病學分會支氣管哮喘防治指南［4］的診斷標準?；颊吣挲g4－45歲。排除妊娠及哺乳期婦女、1個月內全身應用糖皮質激素者、上和／或下呼吸道感染患者以及自身免疫性疾病患者。納入病例按照臨床表現進行分期［4］和分組：急性發作期組（n＝25）、慢性持續期組（n＝23）和臨床緩解期組（n＝25），另選體檢無過敏病史健康人群作為對照組（n＝81）。各組性別、年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。見表1。

1.2 標本采集和處理

抽取研究對象空腹靜脈血2－3ml置于促凝管中，分離血清后保存于－70℃冰箱，用于檢測血清ⅠL－2、ⅠL－4和 SⅠgE 水平；抽取研究對象靜脈血約2ml置于EDTA抗凝管中，保存于－20℃冰箱，用于提取外周血基因組DNA。

表1 各組基線資料

1.3 各組ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平檢測

采用ELⅠSA。ⅠL－2和ⅠL－4檢測試劑盒購自武漢藍恒生物有限公司（批號：00641、01012），SⅠgE檢測試劑盒購自福州法瑪西亞普強生物有限公司（批號：4－29051）。三指標均按照試劑盒說明進行檢測與判讀結果。

1.4 ⅠL－2和ⅠL－4基因多態性分析

1.4.1 DNA提?。翰捎萌狣NA提取試劑盒（上海萊楓生物科技有限公司）提取外周血DNA，操作過程參照試劑說明書。－20℃保存。

1.4.2 聚合酶鏈反應（PCR）：根據美國國立生物技術信息中心（National Center of Biotechnology Ⅰnformation，NCBⅠ）網站提供的ⅠL－2和ⅠL－4基因序列，采用 Primer 5.0軟件進行ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284單核苷酸引物設計（表2），用于檢測ⅠL－2rs6534349SNP 中 的 AA 型、GG 型 和 ⅠL－4 rs2227284SNP中的AA型、CC型。PCR擴增條件為95℃3min預變性；95℃30s，58℃50s，72℃1 min，35個循環；最后72℃10min。PCR擴增產物經1.5%DNA凝膠電泳后，采用凝膠自動成像系統拍照后進行電泳條帶定性分析。

1.5 統計學處理

采用 SPSS 17.0統計學軟件。ⅠL－2、ⅠL－4 和SigE血清水平用均數±標準差（±s）表示，多組之間均數比較使用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗；ⅠL－2和ⅠL－4基因型分布用百分數表示，組間比較采用χ2檢驗。相關性分析采用Pearson相關系數法。P＜0.05為差異有統計學意義。

表2 IL－2和IL－4基因分型引物及擴增片段大小

2 結 果

2.1 各組血清ⅠL－2、ⅠL－4及SⅠgE水平比較

單因素方差分析顯示，急性發作期組、慢性持續期組、臨床緩解期組ⅠL－2、ⅠL－4和SⅠgE血清水平與對照組比較差異均有統計學意義（P＜0.05）。ⅠL－2在急性發作期組、慢性持續期組的血清水平明顯高于臨床緩解期組和對照組（P＜0.01）；而在急性發作期組與慢性持續期組、臨床緩解期組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。ⅠL－4在急性發作期組、慢性持續期組血清水平明顯高于臨床緩解期組和對照組（P＜0.01），而在急性發作期組與慢性持續期組、臨床緩解期組與對照組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。SⅠgE在急性發作期組、慢性持續期組和臨床緩解期組的血清水平均明顯高于對照組（P＜0.01），而在急性發作期組、慢性持續期組和臨床緩解期組之間差異無統計學意義（P＞0.05）。見表3。

表3 各組IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

表3 各組IL－2、IL－4和SIgE血清水平（±s）

注：與對照組比較，1）P＜0.01；與臨床緩解期組比較，2）P＜0.01

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2.2 ⅠL－2、ⅠL－4與SⅠgE血清水平的相關性

屋塵螨過敏性哮喘患者隨疾病的進展，其血清SlgE水平呈下降趨勢，而ⅠL－2呈增高趨勢，ⅠL－4呈降低趨勢（表3）。相關性分析結果為SⅠgE水平與ⅠL－2水平呈顯著負相關（為r＝－0.421，P＜0.01），與ⅠL－4水平呈顯著正相關（r＝0.522，P＜0.01）。

2.3 過敏性哮喘組和對照組ⅠL－2rs6534349、ⅠL－4 rs2227284基因型檢測結果

2.3.1 ⅠL－2rs6534349和ⅠL－4rs2227284基因型判讀：在ⅠL－2rs6534349凝膠電泳結果中，如果僅出現AA條帶或GG條帶，判讀為AA型（圖1a）或GG型（圖1b），如果同時出現AA和GG條帶，則判讀為AG型（圖1c）。在ⅠL－4rs2227284凝膠電泳結果中，如果僅出現AA條帶或CC條帶，判讀為AA型（圖1d）或CC型（圖1e），如果同時出現 AA和CC條帶，則判讀為AC型（圖1f）。

2.3.2 過敏性哮喘組和對照組基因型分布頻率比較：過敏性哮喘組ⅠL－2rs6534349GG型頻率與對照組比較明顯降低，差異有統計學意義（χ2＝8.17，P＜0.01）；而ⅠL－4rs2227284CC型頻率與對照組比較明顯升高，差異有統計學意義（χ2＝8.99，P＜0.01）。見表4。

圖1 ⅠL－2 rs6534349和ⅠL－4 rs2227284 SNP基因多態性電泳圖

表4 過敏性哮喘患者IL－2和IL－4基因型頻率比較（n，%）

3 討 論

哮喘是常見的呼吸系統疾病，其發病率逐年上升。目前普遍認為哮喘以多種炎性細胞增加／異常為特征，由多種炎性細胞（嗜酸性粒細胞、淋巴細胞，肥大細胞等）和氣道結構細胞（上皮細胞、血管內皮細胞、平滑肌細胞等）及細胞組分（化學因子、細胞因子等）參與的氣道慢性炎癥性疾?。?］。哮喘不是一種同質性疾病，但不同的表型由于支氣管黏膜腫脹和氣管平滑肌收縮產生了相同的癥狀［6］。在哮喘發作期，細胞因子發生紊亂，主要由于Th0向Th1與Th2細胞分化失調所致。

ⅠL－2由 Th細胞產生，與干擾素－r（ⅠFN－r）共同作用，對ⅠgE的產生及Th2克隆表達起抑制作用。本實驗結果顯示哮喘急性發作期組、慢性持續期組血清ⅠL－2水平下降，臨床緩解期組血清ⅠL－2水平恢復至對照組水平，表明隨著哮喘病情的緩解，ⅠL－2水平逐漸恢復正常。屋塵螨為外源性過敏原，引起外源性哮喘。外源性哮喘患者ⅠL－2水平低下的主要原因可能為：哮喘患者存在免疫功能障礙，ⅠL－2分泌不足；哮喘發作期患者可溶性白細胞介素－2受體（SⅠL－2R）增加，消耗ⅠL－2；哮喘發作期患者釋放大量組織胺，抑制外周血單個核細胞合成ⅠL－2［7］。另外，本研究中ⅠL－2rs6534349GG型在健康人群和哮喘患者之間的差異具有統計學意義，提示哮喘的發作與宿主ⅠL－2基因多態性有一定關系。

ⅠL－4在 Th1、Th2細胞網絡中處于重要地位［8］。ⅠL－4是Th2細胞產生的細胞因子之一，能夠促進B細胞的活化和增殖，調節抗體同種型轉換效應，ⅠgE水平升高，引起Ⅰ型變態反應。本文結果顯示，ⅠL－4在哮喘急性發作期、慢性持續期水平升高，臨床緩解期恢復至對照組水平，表明過敏性哮喘患者出現Th1／Th2亞群功能失衡，表現為Th1功能低下，Th2功能亢進［9］。過敏性哮喘患者活動期ⅠL－4水平增加的主要原因可能為：外源性抗原（屋塵螨）進入機體后，使T細胞活化，Th0細胞表達ⅠL－4等細胞因子受體數量增加，引起以Th2為主的炎癥反應，ⅠgE水平增高，嗜酸性粒細胞、肥大細胞等聚集、激活，分泌毒性蛋白，加重和誘導哮喘的急性發作，引起臨床癥狀［10］。而且ⅠL－4rs2227284CC型在健康人群和哮喘患者之間的差異具有統計學意義，提示哮喘的發作與宿主ⅠL－4基因多態性也有一定關系。

在Ⅰ型變態反應性疾病中，血清SⅠgE升高與疾病相關性的意義遠大于總ⅠgE的變化，因此采用屋塵螨SⅠgE與ⅠL－2及ⅠL－4進行相關性分析優于采用總ⅠgE進行相關性分析。本文結果顯示，SⅠgE在過敏性哮喘組患者中均增高，且三組之間差異無統計學意義。說明ⅠgE介導的超敏反應持續參與了哮喘的發生，且與ⅠL－2和ⅠL－4的水平存在相關性。

綜上所述，屋塵螨引起的特異性哮喘患者存在Th1／Th2免疫調節失衡，其動態平衡的破壞參與了哮喘的發病。ⅠL2、ⅠL4等細胞因子形成的細胞因子網絡在過敏性哮喘的發生、發展及其轉歸中發揮著極其重要的作用。