模擬大深度快速上浮脫險兔血漿血管性血友病因子和一氧化氮水平變化

許 驥 何 佳 陳銳勇 顧靖華 劉曉波 陳 新 向 導

快速上浮脫險是一種先進的潛艇單人脫險技術，基于不減壓潛水的原理，艇員經過脫險艙快速加壓至與艇外壓力平衡后，迅速上浮出水面等待援救［1］。理論上，脫險深度越大，機體高壓暴露時間越長，減壓上浮時循環系統內生成的小氣泡越多，越易造成血液循環障礙，發生減壓病的風險越高。減壓病是現今快速上浮脫險研究邁向大深度所面臨的難題之一。目前，針對大深度快速上浮脫險減壓病的研究很少，也未見報道能客觀反映其損傷和用于臨床診治的敏感指標。本研究采用新西蘭兔模擬大深度快速上浮脫險過程，觀察實驗動物減壓病的發生情況，檢測實驗前和出艙后動物血漿中血管性血友病因子（vWF）、一氧化氮（NO）濃度變化，分析大深度快速上浮脫險對微血管內皮細胞的損傷效應，探尋能反映快速上浮脫險減壓損傷的檢測指標，為深入研究減壓病的發生機制及臨床診治提供實驗依據。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

清潔級成年雄性新西蘭兔16只，體重2.9±0.3kg，購自復旦大學實驗動物中心，許可證號［SCXK（滬）2014－0004］，在本所動物中心適應性飼養一周后進行實驗，飼養期間動物自由飲食。

1.2 主要器材和試劑

模擬快速上浮脫險動物實驗艙（煙臺宏遠公司），3K30型低溫高速離心機（德國Sigma公司），680型全自動酶標儀（美國Bio－Rad公司）等。

vWF檢測試劑盒（酶聯免疫吸附法，批號CEA833Rb）購自武漢優爾生公司，NO檢測試劑盒（硝酸還原酶法，批號A012）購自南京建成公司。

1.3 模擬大深度快速上浮脫險方法

將實驗兔編號標記后置于模擬快速上浮脫險動物實驗艙內，緊閉艙門后由艙控電腦按預設自動加減壓程序，在16s內使用壓縮空氣以指數倍增方式（每4s艙壓增加一倍，即艙壓以2t／4指數速率增加）快速加壓至150m水深壓力（1.5MPa，表壓），穩壓停留80s后，以30KPa／s的速率減壓至常壓后出艙。

1.4 觀察指標和方法

1.4.1 動物行為及減壓病：實驗前及出艙后觀察動物體毛、活動度和反應性，參照實驗兔減壓病診斷標準［2］判斷動物出艙后癥狀，并計算減壓病發生率。

1.4.2 血漿vWF和NO濃度檢測：動物于實驗前和實驗后出艙時從耳緣靜脈各采血2ml置于肝素抗凝管中，4℃，5 000r／min，離心10min分離血漿，分別采用酶聯免疫吸附法及硝酸還原法檢測實驗前和出艙后血漿vWF、NO濃度。

1.5 統計學處理

采用SPSS 19.0統計學軟件。計量數據以均數±標準差（±s）表示，實驗前與出艙后數據比較采用配對t檢驗，P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 動物行為觀察及減壓病發生率

實驗前新西蘭兔活躍自如，體毛順滑，對外界刺激反應靈敏。實驗后出艙時動物均存活，其中5只體毛略顯凌亂，但反應靈敏，行為正常，無明顯減壓病癥狀。另11只出現不同程度的減壓病癥狀，5只病情較輕：體毛凌亂、神態萎靡、行動緩慢、對刺激反應遲鈍；6只病情較重：除上述癥狀外，還有后肢癱瘓、急促喘息等表現，10min內死亡1只。10只存活減壓病兔癥狀均在出艙后1－3h內陸續自行消失，行為逐漸恢復正常。

2.2 血漿vWF和NO濃度變化

出艙后實驗兔血漿vWF、NO濃度較實驗前均有顯著性升高，差異有統計學意義（t值分別為－11.16和－4.93，P＜0.01）。見表1。

表1 實驗前后兔血漿vWF和NO濃度（±s，n＝15）

表1 實驗前后兔血漿vWF和NO濃度（±s，n＝15）

注：與實驗前比較，1）P＜0.01

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3 討 論

以往研究認為，在不安全減壓時，機體組織中溶解的惰性氣體會以小氣泡的形式析出，從而發生氣泡栓塞、機械性壓迫組織并引起機體一系列減壓病病理反應［3］。與常規減壓病有所不同，由于快速上浮脫險過程高壓暴露時間較短（一般不超過幾分鐘），體內惰性氣體飽和－脫飽和過程基本都發生在以血液為代表的快組織（依據惰性氣體在機體各組織中溶解達到半飽和所需時間不同可將全身組織分為各類理論組織，半飽和時間短的為快組織，時間長的為慢組織）中，極少涉及慢組織［4］，故減壓氣泡絕大多數出現于血液中。循環系統內的減壓氣泡對毛細血管和微靜脈影響最大，較大的氣泡會栓塞微血管，或引起微血管形態改變，血小板黏附，血栓形成，血流瘀滯，微循環障礙，進而影響惰性氣體脫飽和，甚至產生大量致病因子，加重減壓病癥狀［5－7］。表明血液中減壓氣泡對血管內皮的應力刺激引發的某些血管內皮因子改變是伴隨著減壓損傷出現的，并可能影響減壓病病程發展。因此針對某些血管內皮因子的研究可以作為快速上浮脫險減壓損傷研究的切入點。

vWF是一種由二硫鍵結合，在正常凝血過程中發揮重要功能的多聚糖蛋白，主要由血管內皮細胞合成，存在 Weibel－Palade小體內。當內皮細胞損傷或受到某些物質刺激時，vWF可以在短時間內被釋放入血液中，橋連血小板黏附于血管內皮下結構，并與纖維連接蛋白一起與血小板膜糖蛋白（GP）Ⅱb－Ⅲa結合，誘導血小板聚集和血栓形成；同時，vWF能穩定凝血因子Ⅷ促進其活化，加速凝血［8，9］，成為反映血管內皮損傷和血液高凝狀態的重要標志物之一。在本研究中，動物減壓出艙后血漿中vWF濃度較實驗前顯著升高（P＜0.01），推測原因可能與減壓氣泡擠壓微血管內壁造成內皮損傷而引發vWF大量釋放有關，而且釋放量與動物所受減壓損傷也可能相關。如果循環系統內出現高水平vWF則可能形成血栓，與氣體栓塞一起阻礙微循環，引發臟器缺血，導致減壓病，或加重病情。

NO是一種細胞內和細胞間信使分子，可在內皮細胞中合成，具有廣泛的生物學作用。本研究結果顯示，動物減壓出艙后血漿中NO濃度明顯高于實驗前（P＜0.01）。高濃度NO可導致血管擴張，同時妨礙血小板黏附和聚集［10］。結合快速減壓損傷實驗后動物血管內血小板黏附、聚集、血栓化，微血管先出現反應性收縮，然后擴張松弛的現象［11］，推測實驗后動物血液中NO濃度增高很可能是機體出現減壓損傷后的一種應激性保護機制。但微血管后期的擴張松弛會導致血管壁通透性增加，滲出增多，血容量減少，血液流速降低，使得血液中過飽和氣泡不易經肺部排出，而更容易通過擴張后的毛細血管盲端進入原本減壓氣泡很少的深層組織，從而加重減壓病病情。另外，過量的NO與氧自由基迅速反應，生成具有巨大細胞毒性作用的亞硝酸自由基，會對機體造成更嚴重的繼發性損傷［12］。

綜上所述，大深度快速上浮脫險減壓可引起實驗動物血漿中vWF和NO水平升高，表明其內皮細胞受到損傷，可能是減壓病的發病機制之一。相比目前使用行為學觀察或監聽血流氣泡音判別減壓病的方法，血漿vWF和NO濃度測定可提供客觀量化的觀測指標，但其更多作用和功效還需繼續觀察和論證，以期應用于快速上浮脫險減壓病的風險評判、早期診斷和預防治療。