花生AhSOS2基因原核表達載體的構建及表達

張國嘉等

摘要：SOS2（SaltOverlySensitive2）是植物中一類耐鹽相關基因的統稱，在植物對鹽害的響應及適應過程中具有重要作用。本試驗以花生AhSOS2基因全長cDNA為模板，經PCR擴增獲得AhSOS2的蛋白編碼區，將該區段與表達載體pET-28a（+）融合，構建獲得原核表達載體pET-28a-AhSOS2，并進一步在大腸桿菌BL21（DE3）中進行表達。經1.0mmol/LIPTG誘導后，獲得一條約51kD的融合蛋白條帶，且隨著IPTG誘導時間的延長，蛋白表達量逐漸提高，誘導8h可獲得較高的蛋白表達水平。

關鍵詞：花生；AhSOS2；原核表達；融合蛋白

中圖分類號：Q788文獻標識號：A文章編號：1001-4942（2014）01-0006-04

花生（ArachishypogaeaL.）是重要的油料兼經濟作物，我國花生總產居油料作物首位，種植面積居第二位[1]。花生生長過程中經常受到生物或非生物脅迫的影響[2]。其中高鹽脅迫是嚴重危害植物生長發育的非生物脅迫因子之一，對農業生產造成極大的負面影響[3，4]。在受到高鹽脅迫時，植物體內離子平衡遭到破壞，但在長期的進化過程中植物體也形成了一系列防御機制。其中SOS信號途徑是調節離子穩態和提高植物耐鈉性的重要途徑之一[2]。

近年來，國內外對SOS基因家族的研究越來越多，其中SOS1、SOS2、SOS3基因等都已進行轉基因研究，對轉基因擬南芥[5]、蘋果[6]、甘藍[7]等材料的研究結果均證明該家族基因在提高轉基因植物的耐鹽性方面具有一定作用。SOS2是SOS途徑中一類關鍵抗逆相關基因，擬南芥中的研究結果顯示其在耐鹽、抗逆過程中具有重要作用[8]。

前人關于SOS2基因的研究多集中在分子水平上，雖然對部分SOS2基因編碼蛋白的分子量進行了預測，但關于基因原核表達及表達條件優化的報道較少。前期工作中，克隆到花生SOS2基因AhSOS2，大小約1462bp，編碼一個含446個氨基酸的絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，預測該蛋白激酶分子量為51ku[9]。本研究將AhSOS2基因編碼區與原核表達載體pET-28a（+）融合，獲得pET-28a-AhSOS2，測序正確后，轉入大腸桿菌BL21（DE3）感受態中，進行誘導表達，最終獲得蛋白表達產物，為進一步研究該基因的功能奠定了基礎。

1材料與方法

1.1材料與試劑

大腸桿菌DH5α及BL21（DE3）感受態細胞購自北京全式金生物技術有限公司；DNA凝膠回收試劑盒、限制性內切酶及T4DNA連接酶均購自TaKaRa公司；高純質粒回收試劑盒購自北京百泰克生物技術有限公司；引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成；序列測定由山東省農業科學院生物技術研究中心測序室完成。

1.2AhSOS2基因的擴增

以AhSOS2基因的全長cDNA序列為模板，以AhSOS2EcoRⅠ1（5′CGGAATTCATGAAGAAGGTGAGGAATAAGATCG3′）和AhSOS2SalⅠ2（5′-GCGTCGACTACAGTCATTTGTCGAAGCATACC3′）（下劃線分別為EcoRⅠ和SalⅠ酶切位點）為引物，經PCR擴增獲得AhSOS2基因蛋白編碼區。PCR反應體系（20μl）為：PCRmix10μl、10μmol/L上、下游引物各0.5μl、質粒0.1μl、ddH2O補齊。反應程序如下：94℃3min；94℃30s，56℃1.5min，72℃30s，35個循環；最后72℃延伸10min。

1.3AhSOS2原核表達載體的構建及轉化

PCR產物及原核表達載體pET-28a（+）分別經EcoRⅠ和SalⅠ雙酶切，回收酶切片段并純化，用T4DNA連接酶16℃連接過夜，轉化大腸桿菌DH5α感受態細胞，挑取陽性克隆進行酶切鑒定，并送山東省農業科學院生物技術研究中心測序室進行測序，最終獲得重組表達載體pET-28a-AhSOS2。

將測序正確的pET-28a-AhSOS2轉化大腸桿菌BL21（DE3）感受態細胞，經50μg/ml的Kan篩選及PCR鑒定，獲得陽性克隆。

1.4AhSOS2基因的誘導表達及SDS-PAGE檢測

將含有重組質粒pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）陽性克隆振蕩培養，菌液以1∶100比例稀釋于預熱的抗性LB培養液中，培養至OD600值約為0.6后，加入IPTG至終濃度為1.0mmol/L，25℃、200r/min條件下，分別誘導0、2、4、6、8、10和12h。收獲菌液經等量還原性2×SDS樣品緩沖液裂解，12%SDS-PAGE電泳，染色后凝膠成像儀上鑒定并照相。

2結果與分析

2.1AhSOS2基因擴增

經PCR擴增，獲得一條約1350bp的條帶，與預測條帶大小一致（圖1）。

2.3融合蛋白的SDS-PAGE鑒定

如圖5，在25℃下，含有pET-28a-AhSOS2的BL21（DE3）菌體經1.0mmol/LIPTG誘導2h后即可得到明顯的誘導帶，大小約51kD，與預期大小一致，表明AhSOS2基因可在原核系統中表達并獲得誘導產物。且隨誘導時間的延長，AhSOS2蛋白表達量逐漸提高，誘導8h，蛋白表達豐度達到較高水平，之后隨誘導時間的延長略有提高。

3結論與討論

大腸桿菌表達系統是外源基因表達中最成熟、應用最廣泛的原核表達系統[10]，與其它表達系統相比，該系統有諸多優點，如遺傳背景和生化特性非常清楚、操作簡便、成本低、周期短、表達蛋白可大量生產且易于純化等[11]。BL21是目前應用最廣的宿主菌，IPTG在其蛋白表達中起著十分重要的作用。加入IPTG后可使阻遏蛋白不能與操縱基因結合，從而使外源基因大量轉錄，達到高效表達的效果[12]。不同的基因因生化特征及表達蛋白特性不同，其原核表達特點也不同。張傳義等[13]對蘋果AFL1基因進行原核表達時，雖然外源施加IPTG能夠誘導AFL1蛋白的表達，但蛋白表達量不隨誘導時間的延長而改變。李靜等[14]在研究擬南芥AtCOR15a抗寒基因的原核表達時發現，加入IPTG誘導5h，蛋白表達達到較高水平，進一步誘導至8h，蛋白表達量則有所降低。

SOS2是一類公認的抗逆相關基因，在不同物種中關于其生理及功能的研究較多，但原核表達的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區。在此基礎上，利用pET系列載體，構建了AhSOS2基因的原核表達載體pET-28a-AhSOS2，經酶切鑒定及測序正確后，將該重組質粒轉入BL21感受態中。經誘導及條件優化，最終實現了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達。且隨誘導時間的延長，蛋白表達量提高，1mmol/LIPTG誘導8h，蛋白表達豐度達到較高水平，之后隨誘導時間的延長蛋白表達量略有提高。本試驗結果為進一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質、表達調控機制、空間結構及制備特異性抗體等奠定了基礎。

參考文獻：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產業現狀、存在問題及發展對策[J].花生學報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉錄因子的克隆和功能分析[D].濟南：山東師范大學，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達及生物學活性分析[J].中國農業科學，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強子的原核高效表達載體的構建及初步應用[J].生物工程學報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達載體的構建及其在大腸桿菌中的表達[J].山西農業科學，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達載體的構建及蛋白表達[J].新疆農業科學，2010，47（10）：2031-2036.

SOS2是一類公認的抗逆相關基因，在不同物種中關于其生理及功能的研究較多，但原核表達的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區。在此基礎上，利用pET系列載體，構建了AhSOS2基因的原核表達載體pET-28a-AhSOS2，經酶切鑒定及測序正確后，將該重組質粒轉入BL21感受態中。經誘導及條件優化，最終實現了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達。且隨誘導時間的延長，蛋白表達量提高，1mmol/LIPTG誘導8h，蛋白表達豐度達到較高水平，之后隨誘導時間的延長蛋白表達量略有提高。本試驗結果為進一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質、表達調控機制、空間結構及制備特異性抗體等奠定了基礎。

參考文獻：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產業現狀、存在問題及發展對策[J].花生學報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉錄因子的克隆和功能分析[D].濟南：山東師范大學，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達及生物學活性分析[J].中國農業科學，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強子的原核高效表達載體的構建及初步應用[J].生物工程學報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達載體的構建及其在大腸桿菌中的表達[J].山西農業科學，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達載體的構建及蛋白表達[J].新疆農業科學，2010，47（10）：2031-2036.

SOS2是一類公認的抗逆相關基因，在不同物種中關于其生理及功能的研究較多，但原核表達的研究則相對較少。本研究以前期試驗中獲得的AhSOS2基因全長cDNA為模板，通過特異性引物，獲得了AhSOS2基因的蛋白編碼區。在此基礎上，利用pET系列載體，構建了AhSOS2基因的原核表達載體pET-28a-AhSOS2，經酶切鑒定及測序正確后，將該重組質粒轉入BL21感受態中。經誘導及條件優化，最終實現了AhSOS2基因在大腸桿菌中的成功表達。且隨誘導時間的延長，蛋白表達量提高，1mmol/LIPTG誘導8h，蛋白表達豐度達到較高水平，之后隨誘導時間的延長蛋白表達量略有提高。本試驗結果為進一步研究AhSOS2基因及編碼蛋白的理化性質、表達調控機制、空間結構及制備特異性抗體等奠定了基礎。

參考文獻：

[1]湯松，禹山林，廖伯壽，等.我國花生產業現狀、存在問題及發展對策[J].花生學報，2010，39（3）：35-38.

[2]邵鳳霞.花生NAC轉錄因子的克隆和功能分析[D].濟南：山東師范大學，2009.

[3]ApseMP，AharonGS，SneddenWA，etal.Salttoleranceconferredbyover-expressionofavacuolarNa+/H+antiporterinArabidopsis[J].Science，1999，285：1256-1258.

[4]ZhuJK.Plantsalttolerance[J].TrendsPlantSci.，2001，6（2）：66-71.

[5]FujiiH，ZhuJK.AnautophosphorylationsiteoftheproteinkinaseSOS2isimportantforsalttoleranceinArabidopsis[J].MolecularPlant，2009，2：183-190.

[6]HuDG，LiM，LuoH，etal.MolecularcloningandfunctionalcharacterizationofMdSOS2revealsitsinvolvementinsalttoleranceinapplecallusandArabidopsis[J].PlantCell，2012，31：713-722.

[7]KushwahaHR，KumarG，VermaPK，etal.AnalysisofasalinityinducedBjSOS3proteinfromBrassicaindicateittobestructurallyandfunctionallyrelatedtoitsorthologfromArabidopsis[J].PlantPhysiologyandBiochemistry.2011，49（9）：996-1004.

[8]ZhuJK，LiuJ，XiongL.GeneticanalysisofsalttoleranceinArabidopsisthaliana：evidenceofacriticalroleforpotassiumnutrition[J].PlantCell，1998，10：1181-1192.

[9]LiuJ，IshitaniM，HalfterU.TheArabidopsisthalianaSOS2geneencodesaproteinkinasethatisrequiredforsalttolerance[J].Proc.Natl.Acad.Sci.USA，2000，97（7）：3730-3734.

[10]戴漢川，張曉偉，龍良啟，等.鴨leptin基因在大腸桿菌中的融合表達及生物學活性分析[J].中國農業科學，2007，40（11）：2615-2620.

[11]羅文新，張軍，楊海杰，等.一種帶增強子的原核高效表達載體的構建及初步應用[J].生物工程學報，2000，16（5）：578-581.

[12]PatnaikPR.Investigationkrinductioneffectonthesteadystateperformanceofacontinuousforrecombinantβ-galactosidase[J].ProcessBiochemistry，2001，36（11）：1069-1074.

[13]張傳義，孟玉平，孫海峰，等.蘋果AFL1基因原核表達載體的構建及其在大腸桿菌中的表達[J].山西農業科學，2008，36（7）：14-16.

[14]李靜，李曉榮，王冬梅，等.擬南芥AtCOR15a抗寒基因原核表達載體的構建及蛋白表達[J].新疆農業科學，2010，47（10）：2031-2036.