HPLC法測(cè)定中藥愈傷便捷濕巾藥液中梔子苷的含量Δ

楊璐璐，秦學(xué)玲，彭 靜，寧亞功（.成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院中醫(yī)科，昆明 65003；.云南省食品藥品檢驗(yàn)所，昆明 6500）

中藥愈傷便捷濕巾是由梔子、白及、馬勃等藥材提取精制成藥液，以濕巾為載體的一種含藥濕巾，為外用中藥制劑；具有消腫鎮(zhèn)痛、止血愈傷的功效，可用于軟組織扭挫傷所致的腫痛及創(chuàng)傷出血，使用時(shí)將濕巾敷于患處即可。中藥愈傷便捷濕巾具有使用方便、費(fèi)用低廉、易于保存、利于自救互救的特點(diǎn)。梔子是方中君藥，本方主要取梔子涼血解毒、清熱利濕的功效。現(xiàn)代研究發(fā)現(xiàn)，梔子中含40余種生物活性物質(zhì)，主要為環(huán)烯醚萜類和揮發(fā)油類；而國(guó)內(nèi)外公認(rèn)的梔子有效成分為環(huán)烯醚萜類物質(zhì)，其中含量最高的為梔子苷。梔子苷具有抗炎和一定的鎮(zhèn)痛作用。此外，梔子苷還具有抗病毒、保肝利膽、抗腫瘤等作用[1-2]。梔子苷也是梔子質(zhì)量檢測(cè)的法定指標(biāo)成分[3]。目前中藥愈傷便捷濕巾中梔子苷的含量測(cè)定尚未見(jiàn)文獻(xiàn)報(bào)道，為此本研究采用高效液相色譜（HPLC）法測(cè)定中藥愈傷便捷濕巾中梔子苷的含量，以為中藥愈傷便捷濕巾的質(zhì)量控制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型HPLC 儀（日本島津公司）；TB-215D 型電子天平（美國(guó)丹佛儀器有限公司）；UE10SFD型超聲波清洗器（天津奧特賽恩斯儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）。

1.2 藥品與試劑

中藥愈傷便捷濕巾藥液（成都軍區(qū)昆明總醫(yī)院自制，批號(hào)：20130816、20130817、20130818）；梔子苷對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：110749-200714，純度：100%）；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為超純水。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

色譜柱：Aglient Zorbax SB-C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈-0.1%磷酸（10∶90，V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：236 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10μl。色譜見(jiàn)圖1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對(duì)照品溶液 精密稱取梔子苷對(duì)照品0.010 41 g，加甲醇制成每1 ml含梔子苷0.208 2 mg的對(duì)照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 精密量取中藥愈傷便捷濕巾藥液2 ml，置于具塞錐形瓶中，蒸干；精密加入甲醇25 ml，密塞，稱定質(zhì)量，超聲處理20 min，放冷，用甲醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，經(jīng)微孔濾膜（0.45μm）濾過(guò)。精密量取續(xù)濾液10 ml，置于25 ml 量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻；再精密量取5 ml，置于50 ml 量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，濾過(guò)，取續(xù)濾液，即得。

圖1 高效液相色譜圖A.梔子苷對(duì)照品；B.供試品；C.陰性對(duì)照；1.梔子苷Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substance；B.test sample；C.negative control；1.geniposide

2.2.3 陰性對(duì)照溶液 取除梔子外的其他處方藥材各適量，按中藥愈傷便捷濕巾藥液制備工藝制成缺梔子的陰性樣品，再按“2.2.2”項(xiàng)下方法制成陰性對(duì)照溶液。

2.3 線性關(guān)系考察

精密吸取梔子苷對(duì)照品溶液0.5、1、2、3、4、5 ml，分別置于10 ml 量瓶中，加甲醇定容，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定。以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得梔子苷的回歸方程為y＝2 964.8x+31.615（r＝0.999 8）。結(jié)果表明，梔子苷的檢測(cè)進(jìn)樣量線性范圍為0.104 1～1.041μg。

2.4 精密度試驗(yàn)

精密吸取“2.2”項(xiàng)下對(duì)照品溶液10 μl 注入HPLC 儀，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6次，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.23%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取同一批供試品溶液（批號(hào)：20130816）適量，分別于放置0、2、4、8、16 h 時(shí)按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.48%（n＝5），表明供試品溶液在16 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批樣品（批號(hào)：20130816）適量，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液6份，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積。結(jié)果，梔子苷峰面積的RSD為0.07%，表明本方法重復(fù)性良好。

2.7 加樣回收率試驗(yàn)

精密量取已知含量的同一批（批號(hào)：20130816）樣品6 份，每份1 ml，分別精密加入一定量的梔子苷對(duì)照品，按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，記錄峰面積，結(jié)果見(jiàn)表1。

2.8 樣品含量測(cè)定

取3批中藥愈傷便捷濕巾藥液樣品各適量，分別按“2.2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算樣品含量，結(jié)果見(jiàn)表2。

3 討論

本試驗(yàn)曾選用甲醇-水、甲醇-0.1%磷酸、乙腈-水、乙腈-0.1%磷酸作為流動(dòng)相，并調(diào)節(jié)流動(dòng)相的比例，結(jié)果以乙腈-0.1%磷酸（10∶90，V/V）為流動(dòng)相[4-8]時(shí)分離效果佳、峰形好、基線較穩(wěn)定。

表1 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery test（n＝6）

表2 樣品含量測(cè)定結(jié)果（n＝3，mg/ml）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3，mg/ml）

梔子苷對(duì)照品溶液理論上在238 nm波長(zhǎng)處吸收較強(qiáng)[3]，而實(shí)際中供試品溶液中梔子苷在236 nm 波長(zhǎng)處響應(yīng)值最大，且干擾較小，故選擇236 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

本試驗(yàn)考察了回流提取法和超聲提取法，結(jié)果兩種方法提取效率相當(dāng)，由于超聲提取法具有效率高、操作簡(jiǎn)便等優(yōu)點(diǎn)，所以采取超聲提取法[4-10]；本試驗(yàn)還考察了以甲醇、不同比例的甲醇-水為提取溶劑，結(jié)果甲醇提取效果較好、雜質(zhì)成分少，所以采用甲醇為提取溶劑；本試驗(yàn)亦考察了超聲提取時(shí)間20、30、40、60 min，結(jié)果超聲提取20、30、40、60 min提取效率相當(dāng)，故確定超聲提取時(shí)間為20 min。

綜上所述，本試驗(yàn)所建立的方法簡(jiǎn)便、準(zhǔn)確、重復(fù)性好，可用于中藥愈傷便捷濕巾藥液中桅子苷的含量測(cè)定。

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