HPLC-柱前衍生化-雙波長法同時測定妥布霉素地塞米松滴眼液中2種主成分的含量

邰順章，袁步娟，鞏克民，張婷婷（.鹽城市藥品檢驗所，江蘇鹽城 400；.鹽城衛生職業技術學院，江蘇鹽城 4006）

妥布霉素地塞米松滴眼液為混懸型滴眼劑，可用于治療各種急慢性結膜炎、外周性角膜炎、淚囊炎、化學灼傷，及預防各種眼部手術后感染。妥布霉素為氨基糖苷類抗菌藥物，是一種無紫外吸收的化合物，現行標準采用抗生素微生物檢定法[1-3]和高效液相色譜（HPLC）衍生化法[4-6]測定其含量；同時也有采用旋光法、衍生化紫外分光光度法、HPLC-ELSD 法和薄層色譜定量法等測定其含量的文獻報道[7-16]。地塞米松為糖皮質激素類藥物，在甲醇中略溶，在水中幾乎不溶，有紫外吸收，具旋光性，現行標準多采用HPLC法測定其含量[1-6]。目前，該制劑尚未見采用紫外檢測器同時測定2 種主成分含量的報道。為快捷、有效控制妥布霉素地塞米松滴眼液的質量，本試驗對采用HPLC-柱前衍生化-雙波長法同時測定該制劑中2種主成分含量的方法進行了研究。

1 材料

1.1 儀器

LC-20A 型HPLC 儀，包含CTO-20A 型柱溫箱、SPD-20A型紫外檢測器、LC-20AB 型真空脫氣機、SIL-20A 型自動進樣器和LC-20A色譜工作站（日本島津公司）；XS205DU型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 藥品與試劑

妥布霉素地塞米松滴眼液（杭州國光藥業有限公司，批號：140312、140315、140708；齊魯制藥有限公司，批號：131163PG、140623PG、140671PG，規格均為5 ml中含妥布霉素15 mg 和地塞米松5 mg）；妥布霉素對照品（批號：130527-200402，純度：91.4%）、地塞米松對照品（批號：100129-201105，純度：99.7%）均購自中國食品藥品檢定研究院；三羥甲基氨基甲烷（分析純，國藥集團化學試劑有限公司，批號：20100925）；2，4-二硝基氟苯（分析純，成都艾科達化學試劑有限公司，批號：201203211）；甲醇（色譜純，江蘇漢邦科技有限公司，批號：142605）；乙腈（色譜純，美國TEDIA 公司，批號：1205078）；其他化學試劑均為分析純，水為重蒸餾水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件

色譜柱：Agilent C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：0.25%三羥甲基氨基甲烷-乙腈-0.5 mol/L硫酸（40∶59∶1，V/V/V）；流速：1.0 ml/min；檢測波長365、220 nm（在檢測過程中切換波長：0～3.5 min檢測波長為365 nm，3.5～6.0 min檢測波長為220 nm）；柱溫：30 ℃；進樣量：20 μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品貯備液 精密稱取妥布霉素對照品49.26 mg和105 ℃干燥2 h 的地塞米松對照品15.06 mg，置于50 ml 量瓶中，加水適量和0.5 mol/L 硫酸1 ml 使溶解，并用水稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.2 對照品溶液 精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液5 ml，置于50 ml量瓶中，用水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml 量瓶中，各加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml 和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.3 供試品溶液 取本品適量，搖勻后精密量取3 ml，置于100 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，精密量取10 ml，置于50 ml量瓶中，各加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.2.4 陰性對照溶液 精密量取水10 ml，置于50 ml量瓶中，加入2，4-二硝基氟苯乙腈溶液10 ml 和三羥甲基氨基甲烷溶液10 ml，搖勻，置于（60±2）℃的水浴中加熱50 min，放至室溫，用乙腈稀釋至刻度，搖勻，濾過，即得。

2.3 系統適用性和陰性干擾試驗

分別精密吸取“2.2”項下對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl，注入HPLC 儀測定，記錄色譜圖，詳見圖1。由圖1 可見，供試品溶液與對照品溶液中妥布霉素和地塞米松色譜峰保留時間一致，理論塔板數以妥布霉素峰計應不低于3 000，分離度大于3.0。

圖1 高效液相色譜圖A.陰性對照；B.對照品；C.供試品；1.妥布霉素；2.地塞米松Fig 1 HPLC chromatogramsA.negative control；B.reference substance；C.test sample；1.tobramycin；2.dexamethasone

2.4 線性關系考察

分別精密量取“2.2.1”項下對照品貯備液1、3、5、7、10 ml，置于50 ml 量瓶中，按“2.2.2”項下方法制備系列對照品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積。以峰面積（y）為縱坐標、質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標進行線性回歸，得妥布霉素回歸方程為y＝2.570 1×104x－1.198 59×105（r＝0.999 5），地塞米松回歸方程為y＝8.581 8×104x－2.219 81×105（r＝0.999 8）。結果表明，妥布霉素、地塞米松檢測質量濃度線性范圍分別為18.01～180.09、6.02～60.24 μg/ml。

2.5 精密度試驗

取“2.2.2”項下對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6 次，記錄峰面積。結果，妥布霉素和地塞米松峰面積的RSD 分別為0.59%、0.25%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩定性試驗

取“2.2.3”項下供試品溶液（批號：140312）適量，分別于室溫（25 ℃）下放置0、3、6、9、12、15 h 時進樣測定，記錄峰面積。結果，妥布霉素和地塞米松峰面積的RSD 分別為0.74%、0.62%（n＝6），表明供試品溶液室溫放置15 h內穩定性良好。

2.7 重復性試驗

取批號為140312 的樣品適量，按“2.2.3”項下方法平行制備6份供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，按外標法以峰面積計算樣品含量。結果，妥布霉素和地塞米松含量的RSD分別為0.67%、0.22%（n＝6），表明該方法重復性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密量取已含量的樣品（批號：140312）3 ml，置于100 ml量瓶中，共9 份，每3 份一組分別加入“2.2.1”項下對照品貯備液8、10、12 ml，混合后按“2.2.3”項下方法處理和制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.9 樣品含量測定

取6批樣品各適量，分別按“2.2.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，記錄峰面積，代入回歸方程計算2種主成分的含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝2）Tab 2 Results of contents determination of samples（n＝2）

3 討論

妥布霉素是一種無紫外吸收的化合物，采用HPLC紫外檢測法時需用2，4-二硝基氟苯和三羥甲基氨基甲烷進行柱前衍生化，而樣品中地塞米松不與衍生化試劑反應，柱前衍生化對測定地塞米松含量無影響。

本試驗曾分別用乙腈-水（45∶55，V/V）、甲醇-水（45∶55，V/V）、0.25%三羥甲基氨基甲烷溶液-乙腈-0.5 mol/L硫酸溶液（40∶59∶1，V/V/V）作流動相進行考察。結果表明，以0.25%三羥甲基氨基甲烷溶液-乙腈-0.5 mol/L 硫酸溶液（40∶59∶1，V/V/V）為流動相體系時，分離效果較好，能實現對妥布霉素和地塞米松的有效洗脫，且可排除溶劑峰對測定的影響。

本試驗曾分別在240、220 nm 波長處測定地塞米松的含量。結果表明，在240 nm 波長處測定，信號較強，產生信號超載，供試品溶液不能在本方法條件下同時測定2 種組分含量；而在220 nm 波長處信號較合適。故選用220 nm 波長測定地塞米松的含量。

綜上所述，本試驗建立的方法簡便省時、專屬性強、重復性好、結果準確可靠，可用于妥布霉素地塞米松滴眼液的質量控制。

[1]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準（試行）：YBH02182004[S].2004.

[2]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準：YBH11782005[S].2005.

[3]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準：YBH11782006[S].2006.

[4]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準（試行）：WS-224（X-197）-2000[S].2000.

[5]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準：YBH02582007[S].2007.

[6]國家食品藥品監督管理局.妥布霉素地塞米松滴眼液國家食品藥品監督管理局標準：YBH00112008[S].2008.

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