HPLC法同時測定腦血栓丸中芍藥苷和阿魏酸的含量Δ

劉建萍，陳 濤（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院，天津 300193）

腦血栓丸（制劑批準(zhǔn)文號：津藥制字Z20070720號）是我院臨床使用多年的醫(yī)院制劑。該制劑由赤芍、當(dāng)歸、丹參、水蛭等11味中藥組成，具有鎮(zhèn)肝清心、活血通絡(luò)的功效，臨床主要用于腦血栓形成急性期促進(jìn)肢體運(yùn)動功能的恢復(fù)，療效確切。該制劑原質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)僅有薄層鑒別，而無有效成分含量測定。為更好地控制該制劑的質(zhì)量、縮短檢測時間，筆者采用高效液相色譜（HPLC）法同時對其主藥赤芍、當(dāng)歸的有效成分芍藥苷和阿魏酸[1-2]的含量進(jìn)行了測定，以為后期研究提供參考。

1 材料

1.1 儀器

600E型HPLC儀，包括2998二極管陣列檢測器、Empower色譜工作站（美國Waters 公司）；AG135 型電子天平（瑞士Mettler-Toledo公司）；DZKW-S-6型電熱恒溫水浴鍋（北京永光明醫(yī)療儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

腦血栓丸（天津中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院制劑室，批號：121122、130520、131028，規(guī)格：9 g/丸）；芍藥苷對照品（批號：121093-200402）、阿魏酸對照品（批號：111703-200501）均購自中國食品藥品檢定研究院，純度均＞98%；乙腈、冰乙酸均為色譜純，甲醇、乙醚、正丁醇等均為分析純，水為自制超純水。

2 方法與結(jié)果[3-9]

2.1 色譜條件

色譜柱：Waters SunfireTMC18（250 mm×4.6 mm，5.0 μm）；流動相：乙腈-水-冰乙酸（17∶82∶1，V/V/V）；檢測波長：230 nm；流速：1.0 ml/min；柱溫：35 ℃；進(jìn)樣量：20μl。

2.2 溶液的制備

2.2.1 混合對照品溶液 取芍藥苷和阿魏酸對照品各適量，精密稱定，加甲醇分別制成每1 ml 含0.60 mg 芍藥苷和0.47 mg阿魏酸的混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取樣品4 g，剪碎，精密稱定，加甲醇50 ml，索氏提取法提取4 h；提取液回收甲醇并用水浴蒸干，殘渣加熱水20 ml使溶解，轉(zhuǎn)移至分液漏斗中；用乙醚提取3 次，每次20 ml，合并乙醚提取液，水浴蒸干，殘渣用適量甲醇溶解并稀釋至5 ml；水溶液繼續(xù)用水飽和正丁醇提取3 次，每次20 ml，合并正丁醇液，水浴蒸干，殘渣用適量甲醇溶解并稀釋至10 ml。精密量取乙醚層溶液3 ml 和正丁醇層溶液1 ml，置于5 ml棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，即得供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 取不含赤芍和當(dāng)歸藥材的其他藥味，按腦血栓丸的制備工藝制備成缺二者的陰性樣品，再按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 專屬性試驗

精密吸取“2.2”項下混合對照品溶液、供試品溶液和陰性對照溶液各20 μl，按“2.1”項下色譜條件注入HPLC儀，記錄色譜，詳見圖1。由圖1可見，供試品色譜中在與混合對照品色譜芍藥苷和阿魏酸峰相應(yīng)保留時間處有相同色譜峰，而陰性對照在此保留時間處無干擾；并且芍藥苷和阿魏酸峰與相鄰峰分離度均符合要求，表明處方中其他成分對這2個成分含量測定無干擾。

圖1 高效液相色譜圖A.混合對照品；B.供試品；C.陰性對照；1.芍藥苷；2.阿魏酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.mixed reference substance；B.test sample；C.negative control；1.paeoniflorin；2.ferulic acid

2.4 線性關(guān)系考察

精密吸取0.2、0.5、1.0、1.5、2.0 ml的芍藥苷對照品溶液（質(zhì)量濃度0.60 mg/ml），0.1、0.2、0.5、1.0、1.5 ml的阿魏酸對照品溶液（質(zhì)量濃度0.47 mg/ml），分別置于5 ml 棕色量瓶中，用甲醇定容，搖勻，分別制備成0.024、0.060、0.120、0.180、0.240 mg/ml的芍藥苷系列對照品溶液和0.009 4、0.018 8、0.047 0、0.094 0、0.141 0 mg/ml 的阿魏酸系列對照品溶液，分別按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以質(zhì)量濃度（x，mg/ml）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸，得芍藥苷的回歸方程為y＝3.00x－1.58（r＝0.999 9），阿魏酸的回歸方程為y＝1.12x－1.72（r＝0.999 9）。結(jié)果表明，芍藥苷與阿魏酸檢測質(zhì)量濃度線性范圍分別為0.024～0.240、0.009 4～0.141 0 mg/ml。

2.5 精密度試驗

取芍藥苷質(zhì)量濃度為0.060 mg/ml 和阿魏酸質(zhì)量濃度為0.018 8 mg/ml 的混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣測定6次，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD分別為1.37%、1.19%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.6 穩(wěn)定性試驗

取樣品（批號：131028）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于25 ℃下放置0、2、4、8、12、24 h 時按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD 分別為1.76%、1.62%（n＝6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)較穩(wěn)定。

2.7 重復(fù)性試驗

取樣品（批號：131028）適量，共6份，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。結(jié)果，芍藥苷、阿魏酸峰面積的RSD 分別為1.57%、1.49%（n＝6），表明本方法重復(fù)性良好。

2.8 加樣回收率試驗

精密稱取芍藥苷對照品6.20 mg和阿魏酸對照品3.40 mg，置于10 ml量瓶中，用甲醇溶解并定容，搖勻，備用。稱取已知含量的腦血栓丸（批號：131028，含芍藥苷0.308 mg/g、阿魏酸0.171 mg/g）樣品6 份，每份2 g，精密稱定，分別加入上述混合對照品溶液1 ml，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結(jié)果見表1。

表1 加樣回收率試驗結(jié)果（n＝6）Tab 1 Results of recovery tests（n＝6）

2.9 樣品含量測定

取3批腦血栓丸各適量，分別按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進(jìn)樣測定，按外標(biāo)法以峰面積計算芍藥苷和阿魏酸的含量，結(jié)果見表2。

表2 樣品含量測定結(jié)果（n＝3）Tab 2 Results of content determination of samples（n＝3）

3 討論

3.1 提取方法的選擇

本試驗考察了超聲提取、回流提取和索氏提取3種提取方法，結(jié)果表明索氏提取效果較好，不但含量較高，而且峰形和分離度也較好。故最終確定芍藥苷和阿魏酸的提取方法為索氏提取法。

3.2 提取溶劑、次數(shù)的選擇

筆者以有效成分的含量、峰形、分離度為考察指標(biāo)，考察了石油醚、乙醚、乙酸乙酯、水飽和正丁醇等不同提取溶劑組合。結(jié)果表明，乙醚-水飽和正丁醇組合提取成分較完全，峰形和分離度較好。此外，筆者還對提取次數(shù)進(jìn)行了考察，分別考察了提取2、3、4次有效成分含量。結(jié)果表明，隨著提取次數(shù)的增加，有效成分含量隨之增加，但是增加的幅度逐漸變小，考慮檢測時間和成本，以乙醚、水飽和正丁醇分別提取3次為宜。

3.3 流動相的選擇

采用乙腈-水-冰乙酸的體系，選用不同配比進(jìn)行試驗，充分考慮峰形，二主成分峰出峰間隔時間，最終確定流動相為乙腈-水-冰乙酸（17∶82∶1，V/V/V）。

3.4 柱溫的選擇

先后在25、30、35、40 ℃下進(jìn)樣測定，其中35 ℃柱溫條件下分離較好，且峰形對稱，峰面積大小較為穩(wěn)定，最終確定柱溫為35 ℃。

3.5 波長的選擇

芍藥苷最大吸收波長為230 nm，阿魏酸為316 nm。芍藥苷在316 nm 下幾乎無吸收，而阿魏酸在230 nm 下吸收較大。經(jīng)過進(jìn)一步試驗表明，供試品在230 nm和316 nm下測定的阿魏酸含量基本一致。故最終測定波長選擇230 nm。

綜上所述，本方法操作簡單、重復(fù)性好，可用于腦血栓丸的質(zhì)量控制。

[1]楊媛媛，周剛，馬曉康，等.赤芍的研究進(jìn)展[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2008，27（1）：67.

[2]薄華本，陳啟助，沈晗，等.當(dāng)歸補(bǔ)血湯調(diào)控骨髓造血機(jī)理及對造血微環(huán)境的影響[J].中國新藥與臨床雜志，2013，32（10）：824.

[3]朱偉，王學(xué)美.反相高效液相色譜法同時測定補(bǔ)陽還五湯中芍藥苷和阿魏酸的含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報，2006，25（1）：60.

[4]李輝，任平，黃熙，等.高效液相色譜法同時測定健康人口服加味逍遙散后血清阿魏酸和芍藥苷含量及其藥動學(xué)研究[J].中西醫(yī)結(jié)合學(xué)報，2008，6（11）：1 178.

[5]葛志偉，賀慶，林云徑，等.RP-HPLC 法測定杭白芍及其飲片中芍藥內(nèi)酯苷、芍藥苷和苯甲酰芍藥苷[J].中草藥，2008，39（3）：378.

[6]甘洪全，黃熙，屈揚(yáng)，等.RP-HPLC 法同時測定冠心Ⅷ號中的丹參素、原兒茶醛、芍藥苷和阿魏酸[J].第四軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報，2004，25（9）：772.

[7]葛志偉，賀慶，水文波，等.HPLC測定雙丹顆粒中丹酚酸B和芍藥苷的含量[J].中國中藥雜志，2006，31（13）：1 062.

[8]呂光華，程世瓊，陳金泉，等.HPLC測定川芎藥材和飲片中游離阿魏酸和總阿魏酸的含量及其質(zhì)量評價指標(biāo)[J].中國中藥雜志，2010，35（2）：194.

[9]李洋.高效液相色譜法測定活血定痛合劑中阿魏酸的含量[J].中國民族民間醫(yī)藥，2012，21（2）：41.