HPLC法同時測定消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸的含量

王佃榮，陳洪喜，楊智慧（.連云港市第一人民醫院，江蘇連云港 00；.連云港市藥品檢驗所，江蘇連云港 006）

消核靈膠囊（蘇藥制字Z04000076）是連云港市第一人民醫院研制的醫院制劑，是由延胡索、夏枯草、穿山甲、全蝎、斑蝥、蜈蚣6味藥組成的中藥復方制劑，具有解郁散結、調經理氣之功效[1]，可用于乳癖結塊（乳腺小葉增生）的治療。本品原質量標準中無延胡索乙素和迷迭香酸含量的測定，亦未見同時測定上述兩種物質含量方法的報道。為快速、全面控制藥品質量，確保制劑療效，筆者參考相關文獻[2-6]，采用高效液相色譜（HPLC）法同時對消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸含量進行了測定，現報道如下。

1 材料

1.1 儀器

Agilent 1100 型HPLC 儀，包括四元梯度泵、在線脫氣機、VWD 檢測器（美國Agilent 公司）；BP211D 型電子天平（德國Sartorius公司）；SK250HP型超聲儀（上海利導超聲儀器有限公司，功率：250 W，頻率：50 kHz）；ZF-2型紫外光燈（上海安亭儀器廠）。

1.2 藥品與試劑

消核靈膠囊（連云港市第一人民醫院自制，批號：20130304、20130906、20131025，規格：0.3 g/粒）；延胡索乙素對照品（批號：110726-201213）、迷迭香酸對照品（批號：111871-201203）均由中國食品藥品檢定研究院提供，純度均＞98%；乙腈、甲醇為色譜純，其他試劑均為分析純，水為高純水。

2 方法與結果

2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；以0.1%磷酸（以三乙胺調pH 至6.0）-甲醇（45∶55，V/V）為流動相A，0.1%磷酸-甲醇（55∶45，V/V）為流動相B，梯度洗脫（0～22 min，90%→80%A；22～27 min，80%→50%A；27～32 min，50%→20%A；32～60 min，20%→5%A）；流速：0.8 ml/min；檢測波長：282 nm（0～25 min）、330 nm（25.01～60 min）；柱溫：28 ℃；進樣量：10 μl。在此色譜條件下，色譜基線平穩，延胡索乙素峰、迷迭香酸峰與相鄰色譜峰均能達到基線分離，陰性樣品無干擾，理論板數以迷迭香酸峰計不低于5 000，詳見圖1。

2.2 溶液的制備

圖1 高效液相色譜圖A.對照品；B.缺延胡索的陰性對照；C.缺夏枯草的陰性對照；D.供試品；1.延胡索乙素；2.迷迭香酸Fig 1 HPLC chromatogramsA.reference substances；B.negative control of Corydalis yanhusuo；C.negative control of Prunella vulgaris；D.test sample；1.tetrahydropalmatine；2.rosmarinic acid

2.2.1 混合對照品溶液 精密稱取延胡索乙素對照品15.02 mg、迷迭香酸對照品60.32 mg，分別置于100 ml 量瓶中，加70%甲醇溶解并稀釋至刻度，搖勻，制成延胡索乙素質量濃度為150.2μg/ml、迷迭香酸質量濃度為603.2μg/ml 的對照品貯備液。分別精密吸上述對照品貯備液各5 ml，置于同一50 ml量瓶中，加70%甲醇定容，搖勻，即得混合對照品溶液。

2.2.2 供試品溶液 取本品20 粒的內容物，研細，取約1.5 g，精密稱定，精密加入15 ml 70%甲醇，稱定質量，超聲提取45 min，放冷，再稱定質量，用70%甲醇補足減失的質量，搖勻，濾過，取續濾液作為供試品溶液。

2.2.3 陰性對照溶液 按處方工藝分別制備不含延胡索和夏枯草藥材的陰性樣品，并按“2.2.2”項下方法制成陰性對照溶液。

2.3 線性關系考察

取“2.2.1”項下延胡索乙素、迷迭香酸對照品貯備液各5、2、1、0.5、0.2、0.1 ml，置于10 ml量瓶中，用70%甲醇定容，制成系列混合對照品溶液，按“2.1”項下色譜條件進樣測定。以質量濃度（x，μg/ml）為橫坐標、峰面積（y）為縱坐標進行線性回歸，得延胡索乙素回歸方程為y＝1.328×103x－2.715（r＝0.999 8）；迷迭香酸回歸方程為y＝2.169×103x+1.591（r＝0.999 8）。結果表明，延胡索乙素、迷迭香酸檢測質量濃度線性范圍分別為1.502～75.10、6.03～301.6 μg/ml。

2.4 精密度試驗

精密量取“2.2.1”項下混合對照品溶液適量，按“2.1”項下色譜條件重復進樣測定6 次。結果，延胡索乙素、迷迭香酸峰面積的RSD 分別為0.82%、1.28%（n＝6），表明儀器精密度良好。

2.5 穩定性試驗

取樣品（批號：20130304）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，分別于室溫放置0、1、3、5、8、12 h 時按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，延胡索乙素、迷迭香酸峰面積的RSD分別為1.36%、0.98%（n＝6），表明供試品溶液在12 h內穩定。

2.6 重復性試驗

精密稱取同一樣品（批號：20130304）適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，共6份，并按“2.1”項下色譜條件進樣測定。結果，延胡索乙素、迷迭香酸的平均含量分別為51.24、203.2μg/粒，RSD分別為1.12%、1.06%（n＝6），表明本方法重復性較好。

2.7 加樣回收率試驗

精密稱取已知含量的樣品（批號：20130304）內容物1.5 g，共9 份，分別精密加入高、中、低質量的混合對照品，每3 份一組，并按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，并計算加樣回收率，結果見表1。

表1 加樣回收率試驗結果（n＝9）Tab 1 Results of recovery test（n＝9）

2.8 樣品含量測定

取3 批樣品各適量，按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，再按“2.1”項下色譜條件進樣測定，計算樣品含量，結果見表2。

表2 樣品含量測定結果（n＝3，μg/粒）Tab 2 Determination results of samples’contents（n＝3，μg/granule）

2.9 耐用性試驗

取供試品溶液（批號：20130304）適量，在其他色譜條件不變的情況下，分別采用Phenomenex C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Agilent SB C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）、Waters C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）色譜柱進行試驗。結果，不同色譜柱的供試品中延胡索乙素的含量分別為51.24、51.09、50.02 μg/粒；RSD均為1.21%（n＝6），迷迭香酸的含量分別為203.2、202.1、203.5 μg/粒，RSD 均為1.05%（n＝6），表明3 種不同品牌的色譜柱對延胡索乙素和迷迭香酸的含量測定影響均較小，方法耐用性較好。

3 討論

3.1 提取條件的選擇

本研究分別考察了加熱回流法、冷浸提取法和超聲提取法，以30%甲醇溶液、50%甲醇溶液、70%甲醇溶液為提取溶劑，提取30、45、60 min 時的提取效果，結果表明以70%甲醇溶液超聲提取45 min 時延胡索乙素和迷迭香酸的提取效率最高[7]。

3.2 柱溫的選擇

取同一供試品溶液適量，分別在25、28、30 ℃下試驗，結果均能達到基線分離，但25 ℃時迷迭香酸的出峰時間過長，30 ℃時延胡索乙素和相鄰峰的分離度不理想，故選擇28 ℃為本研究的柱溫。

3.3 檢測波長的選擇

根據延胡索乙素和迷迭香酸紫外吸收掃描結果可知，兩者分別在282、330 nm波長處有最大吸收。故為了提高測定靈敏度，本試驗采用了切換檢測波長。結果顯示，該方法具有較高的靈敏度，提高了檢測結果的準確性。

綜上所述，該方法操作簡便，快速易行，結果準確、可靠，可作為消核靈膠囊中延胡索乙素和迷迭香酸的含量測定方法。

[1]李永溟，尹可華，戴翔鈴.HPLC 法測定消核靈膠囊中熊果酸的含量[J].重慶醫學，2002，31（11）：1 145.

[2]國家藥典委員會編.中華人民共和國藥典：一部[S].2010年版.北京：中國醫藥科技出版社，2010：263、525-527.

[3]花汝鳳，姚江雄，黎志堅，等.HPLC同時測定夏桑菊顆粒中迭香酸與異迷迭香酸苷的含量[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（24）：75.

[4]徐婷，曹惠明，金昔陸，等.延胡索乙素臨床應用的研究進展[J].上海中醫藥大學學報，2000，14（4）：60.

[5]王曉玲，鄭振，洪戰英，等.中藥延胡索的化學成分與質量控制研究進展[J].時珍國醫國藥，2011，22（1）：227.

[6]王發，張秉華，郭歡迎.HPLC 法測定復方甘草麻黃堿片中鹽酸麻黃堿和延胡索乙素的含量[J].藥物分析雜志，2010，30（3）：541.

[7]陳玲玲，朱德全，蔡月娥，等.正交試驗優化溪黃草中咖啡酸和迷迭香酸的超聲提取工藝[J].中國實驗方劑學雜志，2013，19（12）：12.